[发明专利]一种基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法

说明书

本发明属于分子生物检测领域，涉及一种基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法。该检测方法以滚环扩增放大外泌体膜蛋白靶标信号，同时利用DNA折纸术引入并有序排列检测单元，从而实现对外泌体膜蛋白含量的检测，包括构建识别单元、滚环扩增、DNA折纸和检测等步骤。本发明以滚环扩增进行信号放大，无需高温变性过程，反应迅速，操作简单，提高检测灵敏度。本发明还包括检测方法中使用的识别单元及其应用。本发明利用DNA折纸的技术对扩增产物进行折叠，使引入的检测序列可以有序的排布，避免了检测序列缠绕，进一步提高检测的灵敏度。

技术领域

本发明属于纳米生物传感领域，涉及一种检测外泌体膜蛋白的方法。本发明具体涉及一种以滚环扩增放大外泌体膜蛋白信号的方法，同时利用DNA折纸术引入并有序排列检测单元，从而实现对外泌体膜蛋白的检测。

背景技术

外泌体是一种由活细胞分泌，直径约为30-150 nm，来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡结构，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等体液中。外泌体被认为参与肿瘤细胞与肿瘤微环境的细胞间通讯从而调控癌症发展。外泌体参与癌症发展的多项重要过程，如细胞增殖和迁移、新生血管生成、细胞死亡逃逸、侵袭和转移。受肿瘤微环境的干预（如微酸pH、缺氧和炎症，以及光化疗等），癌症相关外泌体释放量增加，同时外泌体的生物特性及内含物响应性变化，从而导致信号通路发生变化。例如，癌细胞相关外泌体通过抑制T细胞免疫直接或间接抑制抗原呈递细胞介导的交叉至敏，从而促使免疫抑制和肿瘤微环境生成，进而促进癌症进程。此外，受癌信号的驱动，外泌体表面富集了大量的肿瘤特异性蛋白，并且其内部富含丰富的核酸内含物，为判断癌症发展和转移提供了丰富的信息。因此，癌源相关外泌体已成为检测癌症进展的潜在生物标志物。

鉴于外泌体的重要功能，外泌体相关检测已经成为重要课题，如何快速、准确的检测外泌体及相关生物标志物是本领域的热点和难点。

发明内容

本发明目的在于提供一种外泌体膜蛋白检测方法，在不需要高温变性过程的情况下，迅速、简便、灵敏的实现对外泌体膜蛋白含量的检测。

本发明的再一目的在于：提供一种发夹结构。

本发明的又一目的在于：提供所述发夹结构的应用。

为了实现上述目的，本发明比较和优化了众多的检测技术，并选择将滚环扩增和DNA折纸术结合应用于外泌体膜蛋白的检测。

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是以环状DNA分子为模板，以短的与环DNA互补或部分互补的DNA或RNA为引物，在phi29 DNA聚合酶的催化下，合成一条带有大量重复序列的很长的DNA单链的核酸扩增方法，同时它也是一种恒温的核酸扩增方法，不需要高温变性的过程。

DNA折纸术可以利用数百条互补的短ss-DNA（订书钉链），在高阳离子浓度下，将一条7308个碱基的长ss-DNA（脚手架链）折叠为任意图案。而滚环扩增所得到的长的单链DNA是很好的进行DNA折纸的模板。由于滚环扩增所得长链携带大量重复序列，因此又可以进一步减少订书钉链的使用。

本发明的目的通过以下方案实现：以滚环扩增放大外泌体膜蛋白靶标信号，同时利用DNA折纸术引入并有序排列检测单元，从而实现对外泌体膜蛋白含量的检测。

本发明的基于滚环扩增和DNA折纸术的外泌体膜蛋白检测方法，包括以下步骤：

（1）构建识别单元：构建带有外泌体膜蛋白aptamer（核酸适配体）和引物链的发夹结构的识别单元；

（2）滚环扩增：将识别单元与外泌体孵育，识别单元与膜蛋白识别后，释放引物链，引发滚环扩增，得到一条长的具有重复序列的DNA单链；

（3）DNA折纸：利用DNA折纸技术，将扩增产物有序折叠，同时引入富含鸟嘌呤的序列，在有K⁺(钾离子)存在的条件下，该序列能形成G-四联体；