[发明专利]一种过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA、制备方法及其应用

说明书

本发明公开一种过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV‑SNCA、制备方法及其应用，属于生物技术和医药领域，其技术方案包括构建过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV‑SNCA和高滴度的AAV‑SNCA病毒滴度包装制备，将过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV‑SNCA制备成针剂运用在膀胱癌治疗中，可以有效抑制肿瘤生长。

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域，特别涉及一种过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA、制备方法及其应用。

背景技术

近些年，基因疗法在肿瘤治疗领域取得了重大突破，作为递送基因疗法的有力工具，腺相关病毒(AAV)具有免疫原性地、安全性高、扩散性强等特点备受关注。截止到目前，在ClinicalTrial.gov上已有164项干预临床试验中使用重组AAV载体。作为泌尿系统中第一恶性肿瘤-膀胱癌，位列我国男性恶性肿瘤发病率第七，而且呈逐年上升趋势。膀胱癌的传统治疗方法主要有手术和化疗。手术不可能完全切除所有的肿瘤，因此很容易发生术后复发。化疗会同时损伤癌细胞和正常细胞，对患者造成严重的副作用。临床上，治疗膀胱癌的药物是通过尿道灌注而不是进入血液，通过膀胱镜检查观察和取样进行治疗试验有很多的局限性。因此，需要寻找可靠的治疗靶点，采用基因载体传递靶基因制备成针剂进行治疗成为一种高效、安全的治策策略。

编码α突触核蛋白的基因SNCA，是第一个被报道其突变参与自发性PD病理进程的基因，在PD中扮演着重要的角色。SNCA的正常功能尚不清楚，研究发现与突触可塑性、多巴胺能神经递质传递、囊泡循环、脂质代谢，分子伴侣活性，与多种蛋白质之间发生相互作用。另外，越来越多的研究报道SNCA还可能参与抗凋亡和促凋亡过程，氧化应激，钙调节与线粒体内稳态，细胞周期重组等生命过程近些年，已有研究报道SNCA参与宫颈癌、结肠癌、黑色素瘤。脑癌和肺腺癌的发生。

发明内容

为了显著抑制膀胱癌肿瘤的生长的同时减少治疗膀胱癌的副作用，本发明提供一种过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA、制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，一种过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA的制备方法，包括以下步骤：

(1)将人源SNCA的基因序列设计PCR扩增引物，引入酶切位点SalⅠ和 Xhol，采用腺相关病毒过表达质粒pAAV-IRES-hrGFP为骨架，构建入人源SNCA 基因序列构建质粒，质粒命名为AAV-SNCA；

(2)将过表达SNCA的AAV-SNCA进行病毒包装和纯化，所述病毒滴度为1×10¹³vectorgenome(V.G.)/ml。

进一步地，所述过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA在制备治疗膀胱癌的制剂中的应用。

有益效果：

通过TCGA数据库筛查，发现在膀胱癌中SNCA的表达显著下调，提示其可能参与膀胱癌的发生发展。因此通过AAV载体递送SNCA至小鼠膀胱癌肿瘤模型中，通过治疗实验发现其能显著抑制肿瘤的生长。过表达SNCA的腺相关病毒载体AAV-SNCA制备成针剂应用在抗膀胱癌肿瘤，可以成为一种理想的膀胱癌基因治疗策略。

附图说明

图1为采用Westernblotting检测AAV-SNCA与对照组的病毒基因表达结果图；

图2为本发明的动物实验流程图；

图3为治疗过程肿瘤生长情况统计图；

图4为治疗过程红外成像系统监测肿瘤生长情况图；

图5为处死小鼠后的肿瘤测量图；