[发明专利]一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用

权利要求书

1.一种脐带间质干细胞外泌体的分离和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对脐带间质干细胞进行分离培养至P3代，待P3代hucMSC的融合度达50％～60％时洗涤，将洗涤后的P3代hucMSC置于去血清外泌体的α-MEM培养基培养至P6代，取hucMSC上清；所述α-MEM培养基中还有质量含量为10％的胎牛血清；

(2)对所述hucMSC上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex；

所述离心包括对所述hucMSC上清依次进行：第一离心、第一离心的上清液进行第二离心、第二离心的上清液进行第一超滤离心，第一超滤离心的膜上液进行第三离心，利用PBS缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集第二超滤离心的膜上液；

所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；

所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；

所述第一超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；

所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于质量百分含量为30％蔗糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；

第二超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min。

2.根据权利要求1所述分离和纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的温度均为4℃。

3.根据权利要求1所述分离和纯化方法，其特征在于，步骤(2)收集第二超滤离心的膜上液后过0.22μm滤膜，滤液为所述hucMSC-Ex。

4.利用权利要求1～3任一项所述分离和纯化方法得到的脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex。

5.一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将miRNA13896 mimics的水溶液和权利要求4所述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液混合后进行电转，将电转液置于37℃孵育1h，得所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体；

所述miRNA13896的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述miRNA13896 mimics的水溶液和脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的体积比为1：9。

7.根据权利要求5或6所述制备方法，其特征在于，所述miRNA13896mimics的水溶液的工作浓度为0.5μg/μL；所述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的工作浓度为30μg/μL。

8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述电转的参数包括：选择衰减模式，调节穿孔电压为110V，穿孔电压持续时间为3ms，穿孔后静息时间为10ms；驱动电压为25V，驱动电压持续时间为50ms，驱动后静息时间为50ms；驱动循环次数为10次，电容为940μF。

9.利用权利要求5～8任一项所述制备方法制备得到的miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体。

10.权利要求4所述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex或权利要求9所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体在制备预防和/或治疗胃癌药物中的应用。