[发明专利]一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒

权利要求书

1.一种血液样本中病原菌DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将血液样本与足量的皂素Saponin充分混合，血液样本中的非病原菌细胞被Saponin裂解；

(b)待血液样本由浑浊变透明后，离心富集病原菌，弃掉上清；

(c)离心沉淀中加入叠氮溴化丙锭PMA溶液，震荡重悬，避光孵育，然后亮处光解；

(d)按照常规DNA提取方法从光解后混合物中分离制备病原菌DNA。

2.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中皂素Saponin先溶于水，再跟临床血液样本混合。

3.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为0.1％-0.5％，裂解温度为室温，裂解时间为30min。

4.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为1％-2％，裂解温度为室温，裂解时间为5-10min。

5.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中待血液样本由浑浊变透明后，加入等体积5M的NaCl溶液混匀，室温下孵育1分钟后，20000×g离心15-20分钟富集病原菌，弃掉上清，将沉淀用PBS缓冲液重悬。

6.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中加入PMA溶液后PMA终浓度为10-20μM，光解时间为25min。

7.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中加入PMA溶液后PMA终浓度为50μM，光解时间为5min。

8.根据权利要求1所述病原菌DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中震荡重悬混匀后的样品，室温避光孵育2-10min后，在465-475nm的特定光源照射下曝光5-30min。

9.一种临床血液样本中病原菌DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Saponin溶液、叠氮溴化丙锭PMA溶液和常规DNA提取试剂。

10.一种临床病原菌感染诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Saponin溶液，叠氮溴化丙锭PMA溶液，常规DNA提取试剂盒、荧光定量PCR(QPCR)反应试剂和病原菌特异性检测引物。