[发明专利]一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒。所述方法包括：(a)将血液样本与足量的皂素Saponin充分混合，(b)待血液样本由浑浊变透明后，离心富集病原菌，弃掉上清；(c)离心沉淀中加入叠氮溴化丙锭PMA溶液，震荡重悬，避光孵育，然后亮处光解；(d)按照常规DNA提取方法从光解后混合物中分离制备病原菌DNA。本发明利用血液样本中病原菌细胞和非病原菌细胞的胞壁结构差异，裂解并去除非病原菌DNA，提高了病原菌检测的灵敏度和稳定性。

技术领域

本发明属于病原菌感染的分子诊断学领域，具体涉及一种血液样本中病原菌DNA的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒。

背景技术

临床微生物学实验室目前用于鉴定病人系统性感染常用的标准方法是血培养。然而，由于血中病原菌数量过少而导致血培养方法的灵敏度非常低下，甚至有些细菌是不可培养型的，无法在体外培养生长。另外，血培养方法周期长，通常需要3—7天的时间才有可能得到结果，极大的延误对致病菌的精准定性和对病人的有效用药，从而加速耐药菌的形成。

近年来，荧光定量PCR(QPCR)技术在传染性疾病的分子诊断领域逐渐得到广泛的应用。理论上讲，QPCR反应方法对病原微生物的检测既特异灵敏又快速便捷。然而，从实际操作来看，这些以PCR为基础的诊断方法目前还没有显示出比血培养方法有更大的优越性，甚至还不如传统的血培养方法有效。其主要原因之一是临床样本中含有大量的宿主DNA，这些宿主DNA的存在严重的干扰了QPCR方法的特异性和灵敏度。

QPCR诊断方法的专一性和灵敏度在很大程度上取决于检测样品DNA的提取方法。目前的常规核酸提取试剂盒用于提取临床样本中DNA的时候区分不开宿主DNA和病原菌DNA。因此，所得的DNA实质上是病原菌DNA和宿主DNA(如人血液细胞DNA)的混合物。而病原菌DNA的占比非常小，这极大的降低了QPCR的灵敏度。另外，用于检测病原菌的引物可能会与宿主DNA非特异性结合，导致假阳性或者假阴性结果的出现。临床样本中提取的DNA中病原菌DNA的占比越小，则产生假阳性或者假阴性结果的可能性越大。

通常用于病原菌鉴定的临床血液样本中存在的病原菌数量极少，如某些血流感染患者的血液样本中细菌含量仅有约10CFU/ml。从这样的临床样本中制备的DNA仅有痕量的病原菌DNA分子，而绝大多数的DNA都是宿主DNA。临床分子诊断的目标就是要求从这样的样品中检测证明是否有病原菌DNA的存在，从而准确无误的做出诊断结果(鉴定导致感染的病原菌)。占绝大多数的宿主DNA在临床样本中的存在，给QPCR反应在传染性疾病诊断上的应用带来了严峻的困难和挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种能从临床血液样本中有效去除宿主血细胞DNA，富集病原菌DNA的制备方法。利用本方法制备的DNA进行QPCR反应，能尽量避免占绝大多数的宿主DNA对QPCR检测病原菌的干扰，在很大程度上提高了PCR反应的特异性和灵敏度。

本发明提供的一种临床血液样本中病原菌DNA的制备方法，包括以下步骤：

(a)将临床血液样本与足量的皂素Saponin充分混合，血液样本中的非病原菌细胞被Saponin裂解；

(b)待血液样本由浑浊变透明后，离心富集病原菌，弃掉上清；

(c)离心沉淀中加入叠氮溴化丙锭(PMA)溶液，震荡重悬，避光孵育，然后亮处光解；

(d)按照常规DNA提取方法从光解后混合物中分离制备病原菌DNA。

进一步，所述步骤(a)中皂素Saponin先溶于水，再跟临床血液样本混合。

进一步，所述步骤(a)中皂素Saponin在所述混合体系中的质量百分比浓度为0.1％-0.5％，裂解温度为室温，裂解时间为30min。