[发明专利]重组型DNA聚合酶及其应用

说明书

本发明公开了一种重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。本发明还公开了基于所述重组型DNA聚合酶的核酸分子、表达载体、宿主细胞、制备方法、核酸的扩增方法和试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组型DNA聚合酶及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术被广泛地应用于DNA分子扩增技术中，其中DNA聚合酶作为PCR中的关键组分对DNA的复制起着至关重要的作用。

重组型高保真DNA聚合酶是一种校对DNA聚合酶，具有续进增强域和通用引物退火特性，在保持优良的保真性的同时，扩增量和延伸性也有显著提升。该聚合酶适用于准确性高的应用(如克隆、测序、定点突变)，可具有5′→3′DNA聚合酶活性、3′→5′外切酶活性。

目前，国内外关于高保真DNA聚合酶的研究及应用还在不断地推进，大量的专家学者探索了聚合酶的自身连接方式乃至整体结构域，深入分析了DNA聚合酶活性域、外切酶校对活性域和续进增强域的组成，并在此基础上引入新的延伸因子等。然而，通常的高保真DNA聚合酶碱基延伸速度与扩增片段的长度低于普通的Taq DNA聚合酶，尤其是对于难扩增的模板片段，扩增效率较低。

发明内容

基于此，有必要针对高保真酶对难扩增片段的扩增效率差的问题，提供一种重组型DNA聚合酶及其应用。

重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。

在其中一个实施例中，所述Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。

在其中一个实施例中，所述Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。

重组型DNA聚合酶核酸分子，其含有编码所述的重组型DNA聚合酶的核苷酸序列。

表达载体，包括所述的重组型DNA聚合酶核酸分子。

宿主细胞，包括所述的表达载体。

在其中一个实施例中，所述宿主细胞是微生物细胞。

一种试剂盒，其含有所述的重组型DNA聚合酶。

所述的重组型DNA聚合酶的制备方法，在所述重组型DNA聚合酶表达的条件下培养所述的宿主细胞。

核酸的扩增方法，在适合模板扩增的条件下，采用所述的重组型DNA聚合酶进行PCR扩增。

本发明对Pfu DNA聚合酶-Sso7d蛋白形成的重组型DNA聚合酶进行研究，得到多种重组型DNA聚合酶，发现Sso7d蛋白直接连接到Pfu DNA聚合酶的C端，或者通过特定的蛋白连接肽连接在C端能够明显提高聚合酶对于扩增困难序列的扩增活性，对于PCR扩增的便利应用提供基础。

附图说明