[发明专利]基因融合的检测方法和装置

说明书

本发明提供了基因融合的检测方法和装置。本发明提供了一种基因融合的检测方法，所述方法包括：(1)取待测样本的基因组DNA片段，将所述DNA片段末端加接头；(2)根据接头序列和位于目标区域上游或下游的序列设计PCR引物，以步骤(1)获得的DNA片段为模板进行PCR扩增，获得PCR产物；(3)使用纳米孔测序的方法，对步骤(2)获得的PCR产物进行测序；(4)将步骤(3)得到的测序结果与参照基因组序列比对，以确定所述待测样本的目标区域是否发生基因融合。本发明还提供了一种基因融合的检测装置。本发明提供的方法能够真实反应长读长序列的信息，针对融合断点位于重复序列区域的融合基因检出更具优势。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种基因融合的检测方法，更具体地本发明涉及一种基于纳米孔测序技术进行基因融合检测的方法和装置。

背景技术

融合基因的发现始于20世纪60年代，在慢性粒性白血病病人中发现的费城染色体，拉开了融合基因与疾病的研究序幕，许多疾病的发生都伴随有融合基因现象，例如，白血病常伴随有bcr/abl、AML1/ETO、CBFβ/MYH11、PML/RARα等融合基因，多种实体瘤中也发现融合基因，非小细胞肺癌中有EML4-ALK，前列腺癌中有SLC45A3-ELK4，横纹肌肉瘤中有PAX3-FOXO1等等。科学研究发现，一些融合基因参与了相关疾病的致病过程，因此，这些融合基因的检测可作为诊断标准之一，甚至可将其作为治疗靶点。

融合基因是染色体重排产生的，包括染色体易位、插入、颠倒、缺失。融合基因检测方法包括如下四种：显微镜染色观察、染色体核型显带、荧光原位杂交和高通量测序方法。高通量测序方法研究融合基因的分辨率比前三种更高。然而，当前对融合基因的检测一般基于二代转录组测序数据分析得到。该方法在外显子区设计捕获探针对目标区域进行富集，然后进行二代高深度测序，通过测序数据中跨过融合基因断点位置的reads来判断是否存在基因融合。然而，该方法存在许多不足，首先，其主要通过比对两种类型的读长(reads)来进行。但是由于转录组的复杂性和二代RNA-seq测序读序读长的限制，短读序比对本身就面临非常大的挑战。也就是说高通量测序读长较短，并且设计的靶向探针只有一部分能够捕获到跨过断点的reads，捕获效率难以保证，因此该种检测的灵敏度相对较低。另一方面，二代测序在文库构建过程中会随机产生一些来自不同基因的片段随机连接在一起形成的嵌合读列，采用现有的融合基因检测方法，经常无法区分这些嵌合序列和真正的融合基因序列，这些随机产生的嵌合读列也会被当做融合基因检测出来，造成结果的假阳性。再一方面，相对于基因组水平，转录组水平的融合，融合断点相对固定，且只涉及两个基因的外显子之间的融合。转录组水平的融合可以明确检测到的融合基因已经发生了表达，但无法区分检测到的融合基因在基因组水平就已发生了变异，还是在两个基因分别转录后才发生的RNA融合。进一步地，在外显子区设计捕获探针结合高通量测序的方法虽然可以检测基因组水平的融合，但由于该种水平的融合多发生在内含子区，内含子区本身固有的一些特性，如基因冗长、含大量重复序列，会影响融合断裂点的精准确定。如不同基因间内含子的相似性，会影响序列的准确比对。如高GC区，不利于捕获探针的结合，影响检测灵敏度。

基于此，当前对检测灵敏度更高的基因融合的检测方法存在需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于纳米孔测序技术进行基因融合检测的方法和装置。纳米孔测序技术作为第三代测序技术，具有读长长(可达MB级)和测序速度快(400-500bp/s)的优点。在此基础上，本发明的发明人提供了一种基于纳米孔测序技术的基因融合的检测方法，该方法所需要的样本起始量更低，并且检测灵敏度得到了极大的提高，因此特别适用于生物研究领域和临床医学领域的各种检测，如疾病诊断等。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了一种基因融合的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取待测样本的基因组DNA片段，将所述DNA片段末端加接头；