[发明专利]一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养及传代培养方法

权利要求书

1.一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，将经过预处理的离体新鲜小鼠乳腺癌组织碎块进行清洗后，放入到胶原酶I溶液中进行消化处理；消化处理后加入培养基混匀后离心留取沉淀物；将所得的沉淀物转移至含培养基的培养瓶内后在培养箱中进行培养，培养48h后开始首次更换全部培养基；培养结束后去除未贴壁细胞即获得目标细胞；更换培养基后培养目标细胞，待目标细胞形成细胞集落，细胞融合度达到70％后即获得可传代培养的小鼠乳腺癌细胞，分离培养结束。

2.根据权利要求1所述的小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将经过预处理新鲜离体的小鼠乳腺癌组织标本切成1mm³大小的组织碎片，并利用PBS清洗两次；

(2)将步骤(1)中经过清洗的组织块放入到盛有胶原酶I的EP管内，进一步粉碎成肉泥后消化3min；

(3)向步骤(2)经过消化后的溶液中加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，混合均匀后，离心留取沉淀物；

(4)将步骤(3)所得沉淀物转移至含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶后放在培养箱内进行培养，培养48h后开始首次换液，当培养至无悬浮组织块时培养结束，培养结束后去除未贴壁细胞，获得目标细胞；

(5)使用配方为：89％DMEM/F12+10％FBS+1％三抗的完全培养基培养步骤(4)的目标细胞；培养3～7天当细胞集落形成，细胞融合度达到70％后，即获得可传代培养的小鼠乳腺癌细胞。

3.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述预处理是去除多余的血液、脂肪和结缔组织。

4.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)的胶原酶I经过37℃的预热。

5.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)的培养条件是：37℃、5％CO₂。

6.一种权利要求1～5任一项分离培养方法获得细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将产生集落的细胞中的培养基和组织块去除，并加入PBS进行洗涤，洗涤后弃掉PBS；

(2)向弃掉PBS的细胞培养瓶内加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶均匀覆盖在全部细胞上，在37℃下消化处理0.5～1min；

(3)消化结束后，加入完全培养基终止消化：

(4)将步骤(3)经消化的细胞制成细胞悬液后转移至离心管内离心分离细胞，离心留取细胞沉淀；

(5)向步骤(4)所得的细胞沉淀内加入完全培养基，细胞沉淀重新悬浮后，按照1:2～4的比例进行传代培养。

7.根据权利要求6所述的传代培养方法，其特征在于，步骤(2)所用胰蛋白酶为37℃预热的含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶。

8.根据权利要求6所述的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)是利用显微镜观察细胞状态，当细胞开始变圆时，轻拍培养瓶底部，促使细胞脱落后加入4倍胰蛋白酶体积的完全培养基终止消化。