[发明专利]内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）基于sgRNA的设计原则，在鼠尾5’端和3’端靶位点构建Cas9/sgRNA质粒，构建打靶载体；

（2）Cas9/sgRNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，将构建好的以C57BL/6基因背景的pfn1-flox+/+小鼠与C57BL/6基因背景的VE-Cdherin-Cre小鼠杂交，得到第1代杂合后代小鼠；

（3）对第1代杂合后代小鼠经过基因鉴定，选取pfn1-flox+/+和VE-Cadherin-Cre+/+双阳性的小鼠继续相互杂交得到第2代杂合后代小鼠；

（4）重复步骤（2）至第5代杂合后代小鼠；

（5）选取4周大小的第5代杂合后代小鼠雄性pfn1-flox+/+-VE-Cdherin-Cre+/+的小鼠；

（6）为步骤（5）选取的雄性pfn1-flox+/+-VE-Cdherin-Cre+/+的小鼠连续腹腔注射5天他莫昔芬，注射剂量为10mg/kg，诱导pfn1-flox+/+-Ed-Cre+/+小鼠特异性敲除内皮细胞pfn1。

2.根据权利要求1所述的一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述VE-Cdherin为内皮细胞特异性标记物。

3.根据权利要求1所述的一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述Cas9/sgRNA质粒构建包括：

基于sgRNA的设计原则，在鼠尾5’端和3’端靶位点区域共设计14条sgRNA：

5’Guide

Guide#1：CGGGAGGGTACCGGATATAG GGG

Guide#2： TTCTTAGGAGCCCGGACGCC TGG

Guide#3： GGGGGAGCGGAAGTTCGAAT GGG

Guide#4： ATATCCGGTACCCTCCCGCC CGG

Guide#5： AAGTTCCCCTACGCCGGGCC CGG

Guide#6： AAGTTCCCCTACGCCGGGCC CGG

Guide#7： ACTTAATTAGAGAGCCCCCG GGG

3’Guide

Guide#8： ATACCACTATAGAGGGGCCT AGG

Guide#9： CCATTACATACTAATTCAAC TGG

Guide#10： CCAGTTGAATTAGTATGTAA TGG

Guide#11： GCAGGCTTGGACCCATTCTC TGG

Guide#12： GAGAATGGGTCCAAGCCTGC GGG

Guide#13： CCAAGCCTGCGGGTGAGGCA GGG

Guide#14： CCCTGCCTCACCCGCAGGCT TGG

（2）按照已设计sgRNA序列合成oligos，通过退火聚合的方式连入pCS载体，连接产物转化后送样测序验证正确。