[发明专利]内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明属于动物模型及其应用领域，尤其涉及一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法。其首先将构建好的以C57BL/6基因背景的pfn1‑flox+/+小鼠与C57BL/6基因背景的VE‑Cdherin‑Cre小鼠杂交，得到第1代杂合后代小鼠；选取双阳性的小鼠继续相互杂交得到第2代杂合后代小鼠至第5代杂合后代小鼠；选取4周大小的第5代杂合后代小鼠雄性小鼠；通过连续腹腔注射5天他莫昔芬，诱导小鼠特异性敲除内皮细胞pfn1。

技术领域

本发明属于动物模型及其应用领域，尤其涉及一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

诱导性基因敲除是以Cre/loxp系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是要提供一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法，其具体包括以下步骤：

(1)基于sgRNA的设计原则，在鼠尾5’端和3’端靶位点构建Cas9/sgRNA 质粒，构建打靶载体；

(2)Cas9/sgRNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，将构建好的以 C57BL/6基因背景的pfn1-flox+/+小鼠与C57BL/6基因背景的VE-Cdherin-Cre小鼠杂交，得到第1代杂合后代小鼠；

(3)对第1代杂合后代小鼠经过基因鉴定，选取pfn1-flox+/+和 VE-Cadherin-Cre+/+双阳性的小鼠继续相互杂交得到第2代杂合后代小鼠；

(4)重复步骤(2)至第5代杂合后代小鼠；

(5)选取4周大小的第5代杂合后代小鼠雄性

pfn1-flox+/+-VE-Cdherin-Cre+/+的小鼠；

(6)为步骤(4)选取的雄性pfn1-flox+/+-VE-Cdherin-Cre+/+的小鼠连续腹腔注射5天他莫昔芬，注射剂量为10mg/kg，诱导pfn1-flox+/+-Ed-Cre+/+ 小鼠特异性敲除内皮细胞pfn1。

上述的内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法，其所述 VE-Cdherin为内皮细胞特异性标记物。

上述的一种内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法，其所述 Cas9/sgRNA质粒构建包括：

(1)基于sgRNA的设计原则，在鼠尾5’端和3’端靶位点区域共设计14条 sgRNA：

5’Guide

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Guide#2：TTCTTAGGAGCCCGGACGCC TGG

Guide#3：GGGGGAGCGGAAGTTCGAAT GGG