[发明专利]一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，包括盒体，盒体内有反应杯和试剂；其特征是，反应杯包被有抗原，所述试剂由辣根过氧化物酶标记抗体工作液；恩诺沙星系列标准溶液；20倍浓缩磷酸盐洗涤液；10倍浓缩磷酸盐复溶液；碳量子点荧光反应液A及碳量子点荧光反应液B组成。

2.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，其特征是，反应杯是由聚苯乙烯制备的单孔或8联反应杯，容积为300μL或500μL或其他容积。

3.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，其特征是，碳量子点荧光反应液A包含过氧化氢和碳量子点，碳量子点荧光反应液B包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺和碳量子点。

4.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，其特征是，碳量子点的制备包括如下步骤：

(1)碳量子点的合成：将3g柠檬酸和5g尿素添加到10mL超纯水中以形成透明溶液，然后将溶液在800W微波炉中加热5分钟，在此期间溶液从无色液体变为棕色，最后变为暗褐色的簇状固体，冷却至室温后，加入20mL水以溶解产物；

(2)碳量子点的纯化：将溶解后的产物于5000rpm离心10min后，装入3500Da透析袋，常温下用水透析过夜，得到棕色具有荧光的溶液，在365nm激发光激发下，在400nm-600nm处有荧光。

5.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中恩诺沙星碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，其特征是，所述反应杯包被抗原步骤包括：将恩诺沙星包被抗原用pH9.6碳酸钠缓冲液稀释至0.1μg/mL后向每个反应杯中加入100-300μL，置于4℃冰箱包被过夜，次日向包被抗原的反应杯中加入磷酸盐洗涤液250μL，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将反应杯在滤纸上拍干后，向每个反应杯中加入100-250μL酪蛋白封闭缓冲液，37℃封闭1-2h后弃去反应杯中酪蛋白封闭液，真空密封后在4℃保存。

6.使用权利要求1所述的试剂盒检测恩诺沙星的方法，其特征是，向包被抗原后的反应杯中加入待测物标准溶液或处理好的待测样品，并加入辣根过氧化物酶标记抗体工作液37℃温育20min后向包被抗原的反应杯中加入磷酸盐洗涤液200-500μL，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将反应杯在滤纸上拍干后，加入荧光反应液A和荧光反应液B各50μL，37℃温育10min后检测荧光值，以加入不同浓度恩诺沙星标准品的荧光值求抑制率，以抑制率为纵坐标，恩诺沙星标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，检测限、灵敏度即抑制率为50％时所对应的恩诺沙星浓度IC50能从标准曲线上读出。

7.根据权利要求6所述的检测恩诺沙星的方法，其特征是，抑制率为：

抑制率(％)＝(F_x-F₀)/(F₀-F_b)×100％，其中F₀为检测不含恩诺沙星的溶液时反应杯的检测荧光值，F_x为检测含有恩诺沙星的溶液时反应杯的检测荧光值，F_b为未添加待测物标准溶液或待测样品时反应杯的检测荧光值，以恩诺沙星标准溶液抑制率为纵坐标，恩诺沙星标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以通过样品测定荧光值计算抑制率，并根据抑制率从标准曲线上读出。

8.根据权利要求7所述的试剂盒检测恩诺沙星的方法，其特征是，试剂盒对恩诺沙星的检测限为0.3ng/mL，灵敏度为1.02ng/mL。

9.权利要求7所述的试剂盒检测恩诺沙星的方法，其特征是，所述荧光值是在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。