[发明专利]ATP7B基因敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种ATP7B基因敲除小鼠模型的构建方法。利用CRISPR‑Cas9基因敲除技术，敲除ATP7B基因第2外显子。ATP7B基因敲除后的小鼠均表现为明显的肝脏铜离子淤积等人WD患者临床表现。本发明构建的模拟人WD疾病的小鼠模型，该模型稳定性强且遗传稳定，与人类WD疾病表现类似，可为进一步研究WD发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

技术领域

本发明涉及病理学、遗传学和生物技术领域，具体地说，涉及一种ATP7B基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration，HLD)，又称威尔森病(Wilsondisease，WD)，是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病，人群患病率为3/100,000，亚洲人群的患病率高于欧美。主要致病机制为ATP7B(ATPase Cu2+transporting betapolypeptide,铜离子转运ATP酶β肽)基因突变导致ATP酶功能的减弱或丧失，进而产生一系列铜代谢障碍。其发病隐匿，极易漏诊或误诊，而爆发性肝豆状核变性病情凶险，预后极差。该病是由位于13号染色体上的ATP7B基因发生突变、插入或者缺失引起一类铜离子代谢障碍的疾病。ATP7B蛋白位于反式高尔基体膜上，具有将铜离子运进反式高尔基体中使其与铜蓝蛋白相结合和将多余的铜离子运入胆汁排泄出肝细胞的双重功能。目前，针对肝豆状核变性的治疗手段主要有控制饮食减少铜离子的摄取，利用铜离子螯合剂将淤积的铜排出体外和肝移植三种方法。

ATP7B基因定位于13q14.3，编码P型铜转运ATP酶(P-type ATPase)。ATP7B基因主要在肝脏中高表达，执行将铜离子从胞浆转运至高尔基体，并将过量的铜从肝脏通过胆汁排泄两项功能。生理状态时,ATP7B蛋白主要定位于高尔基体反面网络(Trans GolgiNetwork，TGN),将胞浆中由ATOX1蛋白携带的铜离子传递于此，用于血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin，CP)的生物合成；当铜离子浓度增加时,ATP7B蛋白从TGN上解离，向肝细胞面的胆小管移动,通过胆汁将多余的铜排出体外。

ATP7B复杂而精密的铜转运过程与其特殊的蛋白结构密切相关。人类ATP7B蛋白为具有8次跨膜结构的膜蛋白，其核心结构包括：N端的铜离子结合域(共6个亚基，每个亚基上含有一个金属结合位点(Metal-Binding Site Domain，MBD))、8次跨膜结构(Transmembrane Domain，TMD)、ATP结合域(由核酸结合区域及磷酸化区域共同构成(Nucleotide-binding and Phosphorylation Domains，NBD，包括A、P、N-domain)以及一个较长的C末端。

目前，对ATP7B的分子功能研究多集中于6个MBDs上。MBDs1-4被认为具有调控作用，敲除这些区域并不影响ATP7B的酶活性及其与铜离子的亲和性，但可抑制自身的催化活性。ATP7B蛋白的N端对维持其功能起着重要的作用，但铜离子亦可刺激ATP7B的C端，使其转变为高磷酸化状态，从而促进其转运效率(Braiterman LT,Gupta A,Chaerkady R,ColeRN,Hubbard AL.Communication between the N and C termini is required forcopper-stimulated Ser/Thr phosphorylation of Cu(I)-ATPase(ATP7B)[J].J BiolChem.2015Apr 3,290(14):8803-19.doi:10.1074/jbc.M114.627414.)。