[发明专利]一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法

权利要求书

1.一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述方法包括：将胚胎样干细胞做分组处理并进行培养，在培养基中加入外泌体抑制剂；提取并鉴定外泌体；所述起搏样干细胞产生外泌体miR-127-5p和miRNA，所述胚胎样干细胞产生外泌体NKx2.5，所述外泌体miR-127-5p通过靶向调节外泌体NKx2.5促进胚胎样干细胞分化成起搏样干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述胚胎样干细胞分组包括：培养所述胚胎样干细胞；所述起搏样干细胞和胚胎样干细胞共同培养；在培养基中加入外泌体抑制剂GW4869。

3.根据权利要求1所述的一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述外泌体miR-127-5p促进所述胚胎样干细胞分化包括如下步骤：

利用生物信息学网站预测靶向NKx2.5的共同miRNA，qPCR检测miRNA的表达情况；

通过生物学预测miR-127-5p与Nkx2.5的结合位点，设计荧光素酶报告基因实验证明miR-127-5p与Nkx2.5的启动子区结合。

4.根据权利要求1所述的一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述NKX2.5调节胚胎样干细胞化为起搏样干细胞包括如下步骤：

通过RT-qPCR分析胚胎样干细胞分化成起搏样干细胞过程中不同时间节点细胞样本中Nkx2.5的表达水平；

构建NKX2.5敲除稳转株，qPCR、Western Blot、流式细胞术并检测基因表达。

5.根据权利要求4所述的一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述qPCR、WB检测相关mRNA的表达，免疫荧光检测各组中起搏相关蛋白表达水平，检测搏动频率并验证miR-127-5p的过表达可抑制Nkx2.5的水平表达，进而促进胚胎样干细胞的分化。

6.根据权利要求1所述的一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述提取外泌体包括如下步骤：

培养皿的细胞汇合率达到80％时，把原有培养基吸掉，加0.25％胰蛋白酶进行消化；

细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化；

用移液器吹打细胞，把细胞都悬浮起来并收集，1100转/分钟，离心5分钟；

吸掉上清液，用无exosome血清的培养基清洗细胞一次，1100转/分钟，离心5分钟；

吸掉上清液，加入无exosome血清的培养基，悬浮细胞，传到培养皿中；

继续培养48h后，收集细胞上清，2000rpm,离心10min，然后10000转/分钟，离心30min，去除细胞或者细胞碎片，取上清。

7.根据权利要求1所述的一种促进胚胎样干细胞向起搏样干细胞分化方法，其特征在于，所述鉴定外泌体包括如下步骤：

取20-40μL外泌体沉淀悬液于载样铜网上，室温下静置5min，用滤纸从侧面吸干液体滴加PH＝7.0，4％磷钨酸溶液10μL于铜网上，室温负染5min；滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干15min，负染15min后置于透射电子显微镜下观察外泌体形态并拍照；

将离心得到的外泌体进行径粒分布检测；

用PKH67对分离提取的外泌体进行标记染色。