[发明专利]一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法

权利要求书

1.一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1果蝇幼虫待转染组织器官的制备：取若干只果蝇幼虫为一组，将果蝇幼虫至于PBST中反复清洗数次，去除体表外污垢和污染物，然后在培养皿中滴入灭菌PBS清洗液，在清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染，截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺以及它们所依附的表皮；

S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，加入转染混合液A，在摇床上慢速转染；然后吸净转染混合液A，并使用PBS快速清洗，再加入预培养液B，25℃培养4～6小时；将预培养液B更换为全培养液C，进行培养；

S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，用甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果；

其中，转染混合液A的制备方法按如下比例：向100ul转染混合液母液中加入1ul 5％的洋地黄苷浓储液和200ng待转染质粒，所述转染混合液母液的主体为SHIELDS AND SANG M3INSECT MEDIUM昆虫培养基，每1ml培养基中添加10ul 200mM的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mM丙酮酸钠，另外每1ml转染混合液母液中还添加1ug胃蛋白酶抑制剂、10ug抑肽酶和1ug亮抑酶肽；

预培养液B的制备方法按如下比例：向100ul SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基中加入200ng待转染质粒；

全培养液C的制备方法按如下比例：向主体为SHIELDS AND SANG M3 INSECT MEDIUM昆虫培养基中加入培养液，其中，每900ul培养基中添加10ul 200mM的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mM丙酮酸钠、10ul青霉素和链霉素双抗浓储液和100ul胎牛血清，所述青霉素浓度为10000U/ml，链霉素浓度为10mg/ml。

2.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤S1中，每组果蝇幼虫数量不超过5只，用PBST反复清洗果蝇幼虫外表3次，在含有灭菌PBS的培养皿中解剖。

3.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤S2中，解剖后果蝇组织器官使用PBS快速清洗2次，每次清洗过程如下：利用PBS清洗液进行10次逐滴清洗，且每两次清洗并转移组织器官后，对镊子进行火焰消毒并在空气中冷却待用。

4.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤S2中，转染混合液A的加入量为至少为50ul，在摇床上慢速转染的时间为30min-1h。

5.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤S2中，全培养液C的使用每12小时换液一次，且换液至少3次，保障全培养液C的培养总时间达到48小时，并于每次换液时用室温PBS至少清洗一次。

6.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤S2中，混合转染液A与预培养液B中转染Arm-Gal4 100ng和UAS-GPI-GFP 100ng质粒，总转染质粒质量为200ng。