[发明专利]一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法

说明书

本发明公开了一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，涉及生物技术领域。包括以下步骤：S1果蝇幼虫待转染组织器官的制备；S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，对依次经孵育转染混合液A执行转染、孵育预培养液B稳定转染和使用全培养液C进行转染后的组织器官常规培养；S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果。本发明可以直接转染果蝇幼虫组织器官，48h可观测到果蝇组织器官实现外源基因的转染和成功表达，因技术方案实行12小时换液规则，并且果蝇组织器官培养为25℃，因此微生物污的增殖速度远远达不到污染程度，适用于有菌操作环境。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法。

背景技术

转染(transfection)是体外或体内细胞经过相应的生物技术处理，主动或被动导入外源DNA或RNA片段，继而在细胞内进行蛋白表达或获得新表型的过程(如RNAi)。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染，前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，宿主细胞中可同时存在多拷贝核酸，因此表达水平高，且通常只能维持数天表达，后者亦称作稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为游离体存在。

现代的转染方法分为：化学法、物理法和病毒转染法。其中，化学法包括：磷酸钙法、DEAE-葡氨聚糖法和脂质体法等；物理法包括：显微注射、电穿孔和基因枪等方法；化学法除磷酸钙法，其它类型均需要借助商品化转染试剂，该类试剂由于价格高，用量大，导致单次转染成本较高，另外，商品化转染试剂只能对细胞级别样本进行转染，而对组织无效；而物理法则需要显微注射仪、电转染仪、基因枪等昂贵仪器；病毒转染法需要商品化病毒或自包装病毒，操作流程繁琐，并且现有腺病毒类转染载体等对果蝇细胞组织无效。

同时，现有技术中，常规转染过程一般只对生长期的细胞级别样品进行操作，所以需要高标准的无菌细胞培养环境，并且对增殖分裂能力差的突变体细胞株和体积较大的组织团块几乎无效，进一步增加了转染成本。

发明内容

本发明提供的一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：

一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，包括以下步骤：

S1果蝇幼虫组织器官的制备：取若干只果蝇幼虫为一组，将果蝇幼虫至于PBST中反复清洗数次，去除体表外污垢和污染物，然后在培养皿中滴入灭菌PBS清洗液，在清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染，截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺以及它们所依附的表皮；

实验中可使用普通饲养条件下的果蝇三龄幼虫，如在无菌或减菌条件下饲养能够减小意外污染概率。

S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，加入转染混合液A，在摇床上慢速转染；然后吸净转染混合液A，并使用PBS快速清洗，再加入预培养液B，25℃培养4～6小时；将预培养液B更换为全培养液C，进行培养；一般每孔可培养并转染5只以内的幼虫组织器官；

S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，用甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果；

其中，转染混合液A的制备方法按如下比例：向100ul转染混合液母液中加入1ul5％的洋地黄苷浓储液和200ng待转染质粒，所述转染混合液母液的主体为SHIELDS ANDSANG M3INSECT MEDIUM昆虫培养基，每1ml培养基中添加10ul 200mM的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mM丙酮酸钠，另外每1ml转染混合液母液中还添加1ug胃蛋白酶抑制剂、10ug抑肽酶和1ug亮抑酶肽；