[发明专利]一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用

说明书

本发明提供了一种α‑L‑鼠李糖苷酶突变体及其应用，该突变体是由如SEQ ID NO.1所示序列的野生型α‑L‑鼠李糖苷酶经过其第37或165位氨基酸突变而产生的突变体。与野生型α‑L‑鼠李糖苷酶相比，该突变体的酶活性得到了一定的提高，并且可高效专一的转化柚皮苷制备普鲁宁。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用。

背景技术

普鲁宁是一种具有降低胆固醇、抗氧化及抗病毒等功效的黄酮苷类物质，在食品和药物方面有很好的应用前景。普鲁宁在自然界中的丰度较低，难以从生物组织中提取制备。目前制备普鲁宁主要有化学法和生物法，化学法在高温高压条件，使柚皮苷去掉糖基，该方法需要大量的化学催化剂而且反应条件一般比较激烈，得到的产品副产物多，分离纯化困难。生物法是利用α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷转化为普鲁宁，该方法反应条件温和，对品质影响小，且纯度高、转化率快。

α-L-鼠李糖苷酶能特异性水解许多天然产物的末端α-L-鼠李糖基，可作用于黄酮糖苷类物质中α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键连接的L-鼠李糖。该酶广泛存在于植物、动物和微生物中，可用于柑橘类果汁的脱苦、生物合成普鲁宁和鼠李糖、增加酒的香味、去除橙子果汁中的橙皮苷晶体及提高黄酮的生物活性等。在利用α-L-鼠李糖苷酶水解柑橘黄酮粗提物中的柚皮苷制备普鲁宁中，因为柑橘黄酮粗提物中含有多种黄酮糖苷类化合物，使得产物中不仅产生普鲁宁，还会有其它副产物生成。以柑橘黄酮粗提物为原料制备普鲁宁，需先纯化成柚皮苷，再经过α-L-鼠李糖苷酶水解，进一步纯化为普鲁宁，需要经过2次纯化及2次浓缩结晶才能制备得到普鲁宁，该工艺复杂，得率低。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种α-L-鼠李糖苷酶突变体，其可高效专一的转化柚皮苷制备普鲁宁。

为此，在本发明的第一个方面中，提供了α-L-鼠李糖苷酶突变体，由如SEQ IDNO.1所示序列的野生型α-L-鼠李糖苷酶经过其第37或165位氨基酸突变而产生的突变体。

根据本发明的实施例，所述突变体是将野生型卡拉胶酶的第37或第165位氨基酸进行突变。与野生型α-L-鼠李糖苷酶相比，突变体A37P的酶活是WT的245％，突变体G165E的酶活是WT的176％。二者均可特异性转化柚皮苷生成普鲁宁，没有其它副产物生成，转化率大幅度提高，其中A37P酶活高达8.5IU/ml，在80℃、pH7.0、底物浓度75g/L的反应条件下，转化率达73.51％。G165E酶活高达6IU/ml，在80℃、pH7.0、底物浓度75g/L的反应条件下，转化率达69.45％。该方法具有操作简单、成本低廉等优点，大大降低了生产成本，具有广阔的应用前景。

可选地，第37位氨基酸突变对应的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；第165位氨基酸突变对应的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述α-L-鼠李糖苷酶突变体的基因，第37位氨基酸突变对应的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；第165位氨基酸突变对应的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述α-L-鼠李糖苷酶突变体的基因。

在本发明的第四个方面中，提供了上述α-L-鼠李糖苷酶突变体在制备普鲁宁中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析结果，其中，M：分子量标准蛋白；1：纯化后的AT-Rha；2：纯化后的突变体A37P；3：纯化后的突变体G165E；