[发明专利]用于制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶

说明书

本发明提供了一种利用脱氢酶制备(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：以4‑氯乙酰乙酸乙酯为底物，使用异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3催化还原反应，得到(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用NADP依赖型异丙醇脱氢酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutyrate，CHBE)有两种立体构型，分别是(R)-CHBE和(S)-CHBE，其中(S)-CHBE作为一种重要的医药中间体，可以用于合成海洋溴吡咯生物碱B和C(Slagenins B和C)、他汀类药物-羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂的重要中间体及1,4-二氢吡啶型β阻断剂等，目前对于(S)-CHBE的研究比较多，技术也相对成熟。(R)-CHBE同样作为原料中间体也被广泛用于医药、农药、化妆品等的生产中，如用于合成(R)-4-氨基-3-羟基丁酸、L-肉碱、大内酰亚胺、(R)-4-氨基-3-羟基丁酸、(R)-4-羟基-2-吡咯烷酮、负霉素等，近年来有报道将(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯用于超级他汀类药物。

(R)-4-氯-3-羟基丁酸酯((R)-CHBE)的制备方法主要有两种，化学法和生物酶催化法。化学法主要是在高压条件下，利用手性钌催化剂对4-氯乙酰乙酸乙酯进行加氢还原获得的，该方法也是大规模生产总常用的方法，该方法制备的产物ee值在97％以上，该方法催化剂价格高、反应条件严格、反应设备要求高、能耗大，且产物副产物多、产物收率低、手性纯度低等，因此工艺也逐渐被淘汰。生物酶催化法又分为两种，一种是外消旋体拆分法，另一种是不对称还原法。外消旋体拆分法是混旋的CHBE经酶催化，使得其中一种构型(S)-CHBE发生转酯、氨解或水解反应，从而实现CHBE对映体的分离，最常用的就是脂肪酶(如Novozym435)催化拆分，该方法制备的产品手性纯度较高，ee值超过99％，但反应产物收率低，底物中有一半左右是不能被转化的，原料利用率低。不对称还原法是利用高催化活性和立体选择性的酮还原酶(羰基还原酶)，以4-氯乙酰乙酸乙酯(以下简称为COBE)最为底物，将其3-位的羰基立体选择性地还原成R型的羟基，该方法制备的(R)-CHBE产物ee值也超过99％，底物基本可以被完全利用掉，原料利用率高。

但该方法存在的问题在于，天然发现的立体选择性较好的酶，其酶活相对不高，产业化成本较高，限制了其工业化开发应用。迄今，大多数报道的微生物来源酶催化产生的都是产(S)型CHBE，并同时具有高对映选择性和高产率。但是，仅有极少有酶能产生(R)型CHBE，并伴随立体选择性较低(如ee值70％)或产率低等特性。

发明内容

发明人对于上述酶催化立体选择性还原途径进行了研究，研究重点集中在微生物来源的酮还原酶(羰基还原酶)及其定向突变进化。期间意外地发现一种细菌Caldanaerobacter subterraneus(地下热厌氧杆形菌)来源的NADP依赖型异丙醇脱氢酶(NADP-dependent isopropanol dehydrogenase)也能催化酮基进行立体选择性还原反应，即还具有酮还原酶的功能，是个双功能酶。该脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1(GenBank登录号KUK09008)，当将其应用于4-氯乙酰乙酸乙酯还原时，能够高度立体选择性地还原得到(R)-CHBE；通过对该酶进行突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。因此，本发明包括如下技术方案。

一种酶催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：

以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，使用异丙醇脱氢酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQID NO:3催化还原反应，得到(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

其中，野生型异丙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：