[发明专利]培养哺乳动物细胞的方法

说明书

在此提供一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括种子培养阶段和生产培养阶段，所述种子培养阶段自种子复苏下一代起至少一个代次的培养在金精三羧酸或金精三羧酸盐存在下进行。所述方法改善哺乳动物细胞乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达。

技术领域

本发明涉及哺乳动物细胞培养技术领域，尤其涉及改善哺乳动物宿主细胞生长、代谢及产物表达的方法。

背景技术

通过哺乳动物细胞培养生产基因工程蛋白是一种常用的获得治疗性蛋白如单克隆抗体的方法。其中，CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)是目前最重要、最常用的表达系统。与其他表达系统相比，它具有以下优势：连续细胞系，生长快速，细胞类型均一，可以传代百代以上，便于更大规模生产；属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；具有较好的表达和修饰能力，如糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的一种理想宿主，至今批准的重要重组蛋白及其表达生产主要来自于CHO细胞的表达系统。

提高CHO细胞培养的表现，如提高细胞培养的活率、改善乳酸代谢、提高目标的蛋白产量及质量一直以来都是生物制药领域的关键目标。在细胞培养后期，细胞通常会进入衰亡的状态，这可能与细胞面对的各种各样的压力相关，如有毒性代谢副产物的积累、空间有限、营养缺乏，使细胞后期会进入衰亡的状态，而使细胞维持好的活率有助于提高蛋白的产量以及改善蛋白的质量。另外，乳酸是细胞培养过程中的主要代谢副产物。CHO细胞在代谢旺盛的对数生长期通常会进行乳酸的快速累积，部分细胞株可以将这些乳酸代谢消耗掉，但部分细胞株却缺乏此能力。大量乳酸的累积将严重影响蛋白表达及蛋白质量。乳酸的累积会导致培养体系的pH降低，细胞酸化，而为维持一定的pH添加的碱液往往会增加体系的渗透压，从而影响细胞正常生长代谢。

为了提高蛋白产量及质量，获得稳定的培养工艺，细胞培养科研人员致力于提高培养后期细胞的活率以及降低乳酸的积累。现有技术中提高后期细胞活率的方法包括：降低培养温度、优化补料的策略、替换培养基等，但这些方法可能会导致产量降低或者效果不甚理想。现有技术中减少乳酸积累的方法包括：相关基因敲除，如敲除乳酸脱氢酶(LDH)基因；用代谢缓慢的糖类代替葡萄糖作为碳源，如半乳糖、岩藻糖和麦芽糖；降低葡萄糖的浓度；或者添加铜离子(Cu²⁺)。但这些方法或者可操作性不强，或对细胞的生长及蛋白质量有不利影响。因此，目前细胞培养领域对于提高细胞培养后期的生长和生产表现以及降低乳酸积累的方法或者添加剂都有着特殊的需求。