[发明专利]硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其免疫单克隆抗体的制备和应用

说明书

本发明涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，是通过密码子优化的方式得到硫氧还蛋白还原酶编码基因，如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，并将其在大肠杆菌和哺乳细胞中进行表达，得到重组蛋白，将重组蛋白通过免疫手段得到单克隆抗体对，本发明的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白序列完整，得到的重组蛋白作为标准品制备标准曲线，通过酶动力学法可检测样本TrxR活性，将重组蛋白通过免疫得到的单克隆抗体对，三者形成特异性高的封闭检测体系，可以精准的检测TrxR含量，方法简单，应用广泛。

技术领域

本发明属于基因工程和免疫领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其免疫单克隆抗体。

背景技术

硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。

硫氧还蛋白还原酶是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，包含保守的Cys Val Asn Val Gly Cys氧化还原位点，催化依赖硫氧还蛋白NADPH还原反应。该酶可直接作用于机体的氧化还原、细胞增殖及DNA合成等生理过程，具有调节细胞生长发育和抗氧化应激的作用，该酶在各种细胞中广泛表达，但在肿瘤及异常增生细胞/组织中的表达水平是正常组织的5-10倍以上，因此临床上通过检测人体内外周血TrxR活性、含量水平，可以动态评估机体内异常增生的发生风险和程度，特别是联合TrxR活性和TrxR蛋白水平综合评定，单位蛋白中的活性评定较单一TR活性评定相比具有临床重要意义。由于不可逆恶性增生是肿瘤的重要特征，在癌症的早期阶段该值就会明显升高，因此硫氧还蛋白还原酶是一种特异性、敏感性、广谱性都较高的肿瘤标志物，提高TrxR检测的灵敏度和特异性具有重要的临床价值。显然综合检测TrxR活性和TrxR蛋白具有重要的临床应用现实意义。

因此，体外制备硫氧还蛋白还原酶和相匹配的单克隆单体对技术对于相关疾病的诊断和治疗研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白(TXNRD1)及免疫得到的单克隆抗体对。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。在本发明的一个实施方案中，是对硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化后，通过基因合成的方式得到编码基因。

第三方面，本发明还提供重组载体和/或表达菌株，其特征在于，所述重组载体和/或表达菌株，含有所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因。在本发明一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到表达载体，构成重组载体；例如，所述载体为pET28b；在本发明另一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到克隆载体，构成重组载体；例如，所述载体为pUC19。

第四方面，本发明提供所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因的表达方法，包括如下步骤：

(1)将硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化得到编码基因，利用基因合成的方式得到编码基因，例如，通过线上软件进行氨基酸序列密码子优化；

(2)构建重组载体；

将PCR扩增的DNA序列和质粒载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组载体；所述载体可以为克隆载体或者表达载体；