[发明专利]从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及应用

说明书

本发明提供蛆激酶的制备方法，所述方法包括将蝇蛆进行匀浆、利用调节杂蛋白等电点沉淀法除去杂蛋白，通过离子交换层析与亲和层析纯化，获得蛆激酶，溶纤实验表明制备的蛆激酶具有高活性溶纤效果。本发明的工艺简单，获得的酶比活高，为抗血栓药物研发提供了基础。

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及其应用。

背景技术

血栓的形成是局部的血液凝固导致的，血栓主要成分为不溶性纤维蛋白、血小板、白细胞及红细胞。血栓形成作为一种病理过程，与血管、血小板和凝血酶以及血流速度有关。全世界每年数百万人死于脑梗塞、脑溢血、心肌梗死等与血栓相关的疾病，因此亟待开发有溶栓活性的药物。

溶栓药物可通过人工化学合成和天然提取获得。自然界是获取溶栓药物的天然宝库，天然的溶栓酶来源广泛，小到陆生微生物，大到海洋生物、动物以及植物之中均有溶栓活性成分的发现。来源不同的天然溶栓酶，其降解血栓机制的作用存在差异，从目前的研究报道来看，大部分的溶栓酶均可以通过直接作用于纤维蛋白和激活体内纤溶系统，来高效降解血栓、抑制血栓形成。1980年，须见洋等从发酵纳豆中发现了高溶栓活性的纳豆激酶，后续研究表明纳豆激酶不但能溶解血栓，还能抑制血小板凝固，起到防范血栓形成的作用。1983年日本宫崎大学美原恒教授从蚯蚓提取溶栓蛋白酶蚓激酶，首次从蚯蚓中分离出具有溶栓活性的蚓激酶。此外，从海洋生物中的单环刺螠，蛇毒、黄粉虫、人尿液中亦发现了具有溶栓和抗凝血作用的酶。

发明内容

蝇蛆容易饲养，原料成本低廉，通常以饲料作为商品进行销售，目前尚无蛆激酶的研究方法和生产工艺。本发明提供了从蝇蛆中分离蛆激酶的方法，该酶显示出高溶纤、抗栓活性，为蝇蛆的高附加值开发提供了基础，同时也为新的溶栓药物的开发提供了思路和技术，具有重大的社会价值和经济价值。

具体来说，本发明提供了以下技术方案：

一方面，本发明提供蛆激酶的制备方法，其特征在于包括将蛆激酶提取溶液的pH调节为4.5-6.0，以除去杂质蛋白的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括将蛆激酶提取溶液的pH调节为4.5-6.0，4-8℃静置，以除去杂质蛋白的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括采用亲和填料对蛆激酶进行精制的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括对蛆激酶粗制品进行亲和层析的步骤，所述亲和层析优选阳离子交换树脂CM52。

在一些实施方案中，所述方法还包括在获得蛆激酶粗制品前进行脱盐至电导率100μs/cm的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括对获得的蛆激酶进行辐照或滤膜除菌的步骤。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)将蝇蛆用清水清洗，按原料质量与水或缓冲液质量比为1:3-15进行匀浆；

(2)匀浆液高速离心或过滤，除去杂质和不溶物，得到蛆激酶提取溶液；

(3)调节提取溶液的pH，优选pH范围为4.5-6.0，在低温(4-8℃)静置，待有蛋白沉淀析出，离心去沉淀，收集上清液；

(4)用缓冲液(例如PBS缓冲液)将所述上清液平衡至pH 5～8，缓冲液浓度优选10-50mM，用0.45μm滤膜过滤，获得平衡好的澄清溶液；

(5)利用离子交换树脂，吸附(4)所获得的澄清溶液中的蛆激酶蛋白分子，洗脱后收集活性峰溶液，优选阳离子交换树脂CM52；

(6)将溶液通过超滤或透析，进行脱盐，获得截留分子量为10000-50000道尔顿的蛋白溶液，经浓缩、脱盐至电导率100μs/cm，得到蛆激酶浓缩液；

(7)浓缩液冷冻或真空干燥后，获得粗酶；