[发明专利]一种生物转化合成尿苷的方法

说明书

本发明公开了一种生物转化合成尿苷的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶一步转化为尿苷。与其他工艺相比，本发明反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的尿苷易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9％，具有明显市场竞争力。

技术领域

本发明属于医药合成中生物发酵技术领域，涉及尿苷的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成尿苷的方法。

背景技术

克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要包括肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。

具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。

尿苷，白色针状结晶或粉末，属于核苷类化合物，由尿嘧啶与核糖(呋喃核糖)环组成，两者由β-N1-配糖键相连。尿苷作为一种药物，如抗巨型红血球贫血，治疗肝、脑血管、心血管等疾病，也是制造氟尿嘧啶(S-FC)、脱氧核苷、碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)等药物的主要原料。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从肌苷和尿嘧啶直接转化为尿苷仍然没有突破性进展。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶直接转化为尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

本发明技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程见附图1。

微生物信息：本发明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiellamichiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.16111。

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。

一、菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

菌种：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)

菌株保藏号：CGMCC16111

活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH＝7.0；

培养条件：38℃，200rpm，12h；

菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH＝7.0；

培养条件：38℃，DO≥20％，12-24h；

1.2菌体收集

将菌体培养液离心处理(5000rpm离心10min)，然后湿菌体用pH＝7.0、20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。

二、生物转化反应

2.1反应体系配制