[发明专利]一种N-乙酰氨基葡萄糖生产菌株及其应用

权利要求书

1.一株生产N-乙酰氨基葡萄糖的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)GlmsGNA1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23399，保藏日期2021.09.26，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1的构建方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1以氧化葡萄糖酸杆菌为出发菌株，敲除膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH基因，转入转氨酶基因Glms、乙酰转移酶基因GNA1和启动子T7构建而成。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)根据SEQ ID NO.1所示膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH基因，获取其左右两侧各800bp基因片段同源臂，克隆在载体pOJ260上，得到pOJ260_△mGDH重组质粒；

(2)通过接合转移的方法，将pOJ260△mGDH重组质粒转移到氧化葡萄糖酸杆菌中，筛选得到接合子，再通过无抗传代进行第二次同源重组，筛选得到敲除mGDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌株Gluconobacter oxydans△mGDH；

(3)将T7启动子RNA Poly基因克隆在重组质粒pOJ260△mGDH上，获得含有T7启动子的重组质粒pOJ260△mGDH-T7；

(4)将转氨酶基因Glms，乙酰转移酶基因GNA1，克隆在重组质粒pOJ260△mGDH-T7上，得到含Glms、GNA1基因的重组质粒pOJ260△mGDH-T7-Glms-GNA1；

(5)通过接合转移的方法，将步骤(4)的重组质粒pOJ260△mGDH-T7-Glms-GNA1转移到步骤(2)的氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans△mGDH中，筛选得到氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1。

4.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1的构建方法，其特征在于：

所述转氨酶基因Glms的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述乙酰转移酶基因GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述T7启动子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1在发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1菌株划线至含头孢西丁和安普拉霉素各50μg/mL的山梨醇固体培养基平板上，30℃培养30h，挑取单菌落接种至含头孢西丁和安普拉霉素各50μg/mL的山梨醇液体培养基中，30℃培养18h，然后再按10％体积的接种量接种至含头孢西丁和安普拉霉素各50μg/mL的发酵培养基中，30℃、220rpm振荡培养至OD600＝0.7时加入终浓度0.2mM的IPTG，在30℃培养24h后，获得含N-乙酰氨基葡萄糖的发酵液，分离纯化，获得N-乙酰氨基葡萄糖；

山梨醇液体培养基组成：20g/L山梨醇，3g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，1g/L K₂HPO₄，0.2g/LMgSO₄，溶剂为去离子水；山梨醇固体培养基是在山梨醇液体培养基中加入20g/L的琼脂制得；

发酵培养基组成：100mM葡萄糖，20g/L山梨醇，3g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，1g/L K₂HPO₄，0.2g/L MgSO₄，2g/L谷氨酰胺，溶剂为去离子水。