[发明专利]一种N-乙酰氨基葡萄糖生产菌株及其应用

说明书

本发明涉及了一种葡萄糖胺生产菌株及其构建方法，该技术方案首先对氧化葡萄糖酸杆菌进行底盘细胞的改造，敲除膜结合葡萄糖脱氢酶基因mGDH，选用mGDH左右各800 bp与pOJ260重组获得敲除质粒pOJ260_△mGDH，将该载体转入到氧化葡萄糖酸杆菌中，筛选得到氧化葡萄糖酸杆菌mGDH敲除菌，命名为Gluconobacter oxydans_△mGDH。之后将Glms、GNA1基因与含T7强启动子的pOJ260_△mGDH‑T7重组，获得强化表达的质粒Poj260_△mGDH‑T7‑Glms‑GNA1,将该载体转入到Gluconobacter oxydans_△mGDH菌中，完成葡萄糖胺生产菌的构建，本发明采用的解决上述技术问题的方案提供了一种氧化葡萄糖酸杆菌的改造菌，命名为Gluconobacter oxydans GlmsGNA1，保藏号为(CGMCC No.23399)。发酵结果显示，所构建的Gluconobacter oxydans GlmsGNA1能够以葡萄糖为底物生产N‑乙酰氨基葡萄糖。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖生产菌株及其构建方法。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)是一种非常重要的功能单糖，是葡萄糖分子的2位羟基被一个N-乙酰氨基取代而形成的化合物，是粘多糖和几丁质的重要组成部分，在自然界中广泛分布。GlcNAc作为重要的功能单糖，是人体中葡萄糖胺聚糖(如透明质酸和硫酸软骨素)的组成部分，长期以来被用作治疗骨关节炎、维持软骨和关节健康的药物。

目前生产GlcNAc的方法有甲壳素水解法、微生物发酵法。甲壳素水解法：经H₂SO₄/HCl水解得到N-乙酰胺基葡萄糖。该法虽然具有原料丰富，产率高等优点，但是在环境保护和产品安全等方面存在较多问题，比如原材料的预处理复杂，反应条件剧烈，酸碱废料难处理，获得的GlcNAc不适用于贝类过敏和严格遵循犹太饮食习惯的人等。微生物发酵法主要利用工程大肠杆菌、枯草芽孢杆菌经过基因工程改造以葡萄糖为底物经体内代谢生产N-乙酰氨基葡萄糖，但是大肠杆菌本身存在的内毒素使产品存在安全隐患。

氧化葡萄糖酸杆菌本身可以高效利用葡萄糖，单位生物量的酶活力较高，并且不会产生内毒素，安全等级分类为1级，广泛用于工业生产。氧化葡萄糖酸杆菌体内存在葡萄糖代谢途径，但无法直接得到N-乙酰氨基葡萄糖，因此需要对氧化葡萄糖酸杆菌进行改造，构建N-乙酰氨基葡萄糖生产通路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产N-乙酰氨基葡萄糖菌株的构建方法，得到生产N-乙酰氨基葡萄糖的安全菌株。

本发明的目的还在于提供含代谢基因的重组质粒构建方法。

本发明的第三个目还在于提供该质粒在N-乙酰氨基葡萄糖产生菌遗传改造上的应用。

本发明在氧化葡萄糖酸杆菌中构建N-乙酰氨基葡萄糖生产通路，首先敲除了葡萄糖代谢通路中旁路基因mGDH，引入了高效表达的T7启动子系统，将Glms、GNA1基因通过接合转移整合在氧化葡萄糖酸杆菌基因组上，得到生产N-乙酰氨基葡萄糖的氧化葡萄糖酸杆菌GlmsGNA1。

本发明采用的技术方案是：

一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)GlmsGNA1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23399，保藏日期2021.09.26，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。