[发明专利]一种鉴别火把花根与其混伪品的引物及方法

权利要求书

1.一种鉴别火把花根与其混伪品的引物，其特征在于，包括有引物对ITS2F和ITS3R，其中正向引物ITS2F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物ITS3R的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

2.一种根据权利要求1所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)分别提取火把花根与其混伪品的基因组DNA；

2)分别以步骤1)中提取的取火把花根与其混伪品的基因组DNA为扩增模板，以引物对ITS2F和ITS3R作为引物，进行PCR扩增，分别得到取火把花根与其混伪品的扩增产物；

3)分别将步骤2)中的各扩增产物利用3％琼脂糖凝胶进行电泳检测其DNA纯度，并将扩增好的DNA进行双向测序；

4)分别将步骤3)中所得的各测序峰图利用CodonCode Aligner V 6.0.2软件进行校对拼接，除去引物区，然后基于隐马尔夫模型的HMMer注释方法将所有测得的序列用CodonCode Aligner V 6.0.2除去两端的5.8S和28S区，从而分别获得火把花根与其混伪品的内部转录间隔区ITS2序列；

5)分别将火把花根与其混伪品的ITS2序列与在GenBank上下载的序列，通过MEGA6.0软件进行序列的比对分析，并计算K2P种间遗传距离建立NJtree，同时利用bootstrap重复检验各分支的支持率，使用PseudoViewer2.5，结合ITS2序列分别绘测出火把花根与其混伪品的ITS2二级结构，通过对比火把花根与其混伪品的ITS2二级结构快速准确地鉴别出火把花根与其混伪品。

3.根据权利要求2所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，所述引物对ITS2F和ITS3R中ITS2F为正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，ITS3R为反向引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求2所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，所述火把花根的混伪品包括有雷公藤、东北雷公藤、苦皮藤、南蛇藤、金樱根中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，所述火把花根的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述雷公藤的ITS2核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述东北雷公藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述苦皮藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述南蛇藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述金樱根的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

6.根据权利要求2所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，步骤1)中所述提取火把花根与其混伪品的基因组DNA提取方法为：采用75％乙醇分别擦洗火把花根与其混伪品的表面，并将其分别粉碎成细分，分别取火把花根与其混伪品各60mg，分别加入液氮后，用全自动快速球磨仪研磨5min，30次/s，分别得到火把花根与其混伪品的样品；

利用优化后的植物DNA提取试剂盒，分别对火把花根与其混伪品的样品按照试剂盒说明操作提取样品总DNA，即得分别提取的火把花根与其混伪品样品的DNA模板。

7.根据权利要求6所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，所述优化后的植物DNA提取试剂盒包括有以下试剂：氯仿、缓冲液GP1、冷冻异丙醇、吸附柱CB3、缓冲液GD、漂洗液PW。

8.根据权利要求2所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火最佳温度为56℃，30s；72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min。