[发明专利]一种染色体外环状DNA的建库以及测序方法

权利要求书

1.一种染色体外环状DNA的建库方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样本中的染色体外环状DNA；

2)对所述染色体外环状DNA进行扩增例如多重置换扩增(MDA)以得到其扩增产物；

3)将所述扩增产物打断(例如利用超声)并对DNA片段进行片选；

4)将片选得到的DNA片段进行末端修复和腺苷酸(A)添加，再与接头连接，由此得到带接头的DNA片段；

5)环化步骤4)中得到的带接头的DNA片段，并通过酶例如核酸外切酶如核酸外切酶I和核酸外切酶III消化以去除未环化的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，在提取待检测样本中的染色体外环状DNA之前，在所述待检测样本中添加双链环状DNA，例如其序列为SEQ ID NO:20所示的pUC19质粒和/或其序列为SEQ ID NO:1所示的GAPDH环状DNA，作为阳性对照。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：提取所述待检测样本中的cfDNA，再通过核酸外切酶例如Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase或Exonuclease V(RecBCD)消化所提取cfDNA中的线性DNA，从而获得所述染色体外环状DNA。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，通过片选获得长度为200bp-400bp的DNA片段。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)之后、在步骤5)之前，还包括对所述带接头的DNA片段进行PCR扩增的步骤。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，还包括：在对所述染色体外环状DNA进行扩增后，再通过PCR例如多重PCR通过看家基因验证扩增效果。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述样本是血液、血浆、尿液、唾液、胸腔积液、腹腔积液、粘液或脑脊液等体液。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法的检测下限为最低至5pg染色体外环状DNA/mL所述待检测样本。

9.一种对染色体外环状DNA进行测序的方法，所述方法包括：

a)执行权利要求1-8中任一项所述的染色体外环状DNA的建库方法；

b)对步骤a)中得到的产物进行测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤b)在DNBseq测序平台上进行。

11.一种在染色体外环状DNA测序中用作阳性对照的双链环状DNA，其序列如SEQ IDNO:1所示。

12.一种用于染色体外环状DNA测序的试剂盒，包括：SEQ ID NO:20所示的质粒pUC19和/或SEQ ID NO:1所示的GAPDH环状DNA，作为实验体系的阳性对照。