[发明专利]一种染色体外环状DNA的建库以及测序方法

说明书

本发明属于基因检测领域，更具体而言，本发明提供了一种染色体外环状DNA的建库和测序方法、一种用于检测染色体外环状DNA检测的双链环状DNA以及一种包括所述双链环状DNA的试剂盒。通过本发明的染色体外环状DNA的建库和测序方法，可以对每毫升样本中含量低至5pg的染色体外环状DNA进行检测，并且可以准确有效地区分真阴性结果和假阴性。

技术领域

本发明属于基因测序领域，更具体而言，本发明涉及一种染色体外环状DNA的建库以及测序方法。

背景技术

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA,eccDNA)位于染色体外，呈单链或双链的闭合环状DNA结构，广泛存在各种真核生物中。eccDNA大部分小于25kb，主要分布在0.1kb至5kb之间。因其环状结构特点，相比游离的线性DNA，eccDNA结构稳定，不易被降解。eccDNA的产生与基因组的不稳定性相关。有研究表明，肿瘤细胞中eccDNA染色质高度开放，eccDNA可以携带完整的癌基因，甚至是基因上游的启动子和增强子元件，能独立完成复制过程，本身有高度的转录活性，是肿瘤癌基因的一种新的扩增形式。故eccDNA与肿瘤发生、发展相关，是一种新型的肿瘤标志物。

今年一篇发表在PNAS上的文献(Identification and characterization ofextrachromosomal circular DNA in maternal plasma(https://www.pnas.org/content/117/3/1658))在孕妇的外周血中检测到了eccDNA，证实了eccDNA可以分泌至血液循环系统中，从血浆中可以通过高通量测序技术能被检测到。

现有的检测血浆中eccDNA的方法是基于Illumina测序平台(https://www.pnas.org/content/117/3/1658)进行的，包括基于限制性内切酶MspI消化处理的eccDNA的检测方法以及基于Tn5的tagmentation建库方法。

对于基于MspI的检测方法，需要起始量25ng的循环DNA(circulating free DNA，cfDNA)，将cfDNA经过核酸外切酶Ⅴ消化后过柱纯化回收，利用限制性内切酶MspI将环状DNA酶切成线性DNA后再建库测序。此种方法仅能检测出带有一个MspI酶切位点的环状DNA，而无MspI酶切位点或带有多个MspI酶切位点的eccDNA则无法被检测到，导致检测eccDNA种类少、不全面。

而另一种基于Tn5的tagmentation建库方法，虽然提高了环状DNA检测数目，但是该方法对cfDNA起始量要求高至30ng，因而不适用于微量的cfDNA临床样本。

此外，这两种检测方法实验体系中均无阳性对照，无法解决eccDNA检测时可能出现的假阴性问题。并且目前的eccDNA检测方法都是基于Illumina测序平台，而暂时无基于DNBseq测序平台的检测技术。

因此，本领域亟需一种eccDNA的检测方法，该方法可以对微量的临床样本进行检测，并在实验体系中建立阳性对照，从而更加准确地对eccDNA进行检测。

发明内容

如上所述，现有的eccDNA的检测方法，对eccDNA的检测不够全面和准确，对样本cfDNA起始量要求高，并且所获得的检测结果不够准确。因此，本领域亟需一种eccDNA的检测方法，该方法可以对微量的临床样本进行检测，在实验体系中建立阳性对照，从而更加准确地对eccDNA进行检测。

因此，在第一方面，本发明提供了一种染色体外环状DNA的建库方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样本中的染色体外环状DNA；

2)对所述染色体外环状DNA进行扩增以得到其扩增产物；

3)将所述扩增产物打断并对DNA片段进行片选；