[发明专利]一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)：用TH-150C型智能颗粒物中流量采样器采集待检测环境的PM2.5颗粒一定时间；

步骤(2)：制备PM2.5悬浊液；

步骤(3)：神经细胞PC12的培养

神经细胞PC12接种于培养瓶中，然后加入培养基进行重悬细胞，接种密度为1×10⁴个/瓶，在恒温CO₂培养箱中培养，待细胞覆盖培养瓶80％后得到培养好的神经细胞PC12；恒温CO₂培养箱的培养条件为37℃、5％CO₂，培养时间为24h；

步骤(4)：利用氧糖剥夺装置对步骤(3)培养好的神经细胞PC12进行氧糖剥夺，同时加入步骤(2)不同浓度的PM2.5悬浊液进行染毒，建立细胞氧糖剥夺共PM2.5染毒模型；具体是：

将步骤(3)培养好的神经细胞PC12，用胰酶消化，加培养基终止消化并离心，离心后加入培养基多次吹打均匀，得到细胞悬浮液；然后将上述细胞悬浮液接种到96孔板中，接种密度为8×10³个/孔，待细胞贴壁长满孔板的80％，吸弃原培养基，用PBS洗涤2次，用无糖的DMEM培养基洗涤1次，得到洗涤后的贴壁细胞；在上述保有洗涤后贴壁细胞的96孔板中每孔加入无糖的DMEM培养基和步骤(2)PM2.5悬浊液，然后置于氧糖剥夺装置中，在混合气体通气环境中，OGD和PM2.5染毒联合处理4-8h；最后将96孔板中无糖的DMEM培养基吸弃，PBS清洗一次，再加入培养基和步骤(2)PM2.5，放入CO₂恒温培养箱继续培养2-6h；恒温CO₂培养箱的培养条件为37℃、5％CO₂。

2.根据权利要求1所述的一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于步骤(2)具体是：

2-1将步骤(1)采集得到的粘附有PM2.5颗粒的滤膜浸入超纯水中，放在20-25℃下超声振荡处理60-80min，刮取滤膜表面的PM2.5颗粒，过滤，得到过滤后的悬浮液；

2-2将过滤后的悬浮液分装至离心管中，锡箔纸封瓶，用针扎小口，置于4℃冰箱过夜；隔天对其进行冷冻干燥处理24小时，得到灰黑色颗粒物，即PM2.5颗粒物；将上述PM2.5颗粒物与培养基混合，配制成不同终浓度的悬浊液，置于4℃冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于步骤(2)所述混合气体包括体积比为95：5的氮气和二氧化碳气体。

4.根据权利要求1所述的一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于步骤(2)所述的培养基的主成分包括DMEM培养基88wt％、胎牛血清10wt％、抗生素2wt％。

5.根据权利要求4所述的一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于步骤(2)所述抗生素包括青霉素和链霉素。

6.根据权利要求1所述的一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于步骤(2)所述氧糖剥夺装置包括容器本体、与容器本体可拆卸连接的盖子；容器本体为上端开放的容器，其上端与盖子配合实现密封；在盖子的顶部开有两个通孔，分别作为出气口和进气口。

7.根据权利要求6所述的一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法，其特征在于步骤(2)所述容器本体和盖子的材质为玻璃透明材质。

8.一种用于评估PM2.5暴露对缺血性脑卒中康复的细胞模型，采用权利要求1-7任一项所述方法制备得到的氧糖剥夺共PM2.5染毒模型。