[发明专利]一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法及应用

说明书

本发明公开一种氧糖剥夺共PM2.5染毒模型的构建方法及应用。采用自制的氧糖剥夺装置对神经细胞进行氧糖剥夺造模，其次用不同剂量的PM2.5对氧糖剥夺的细胞进行染毒建立氧糖剥夺共PM2.5染毒模型，用于评估外源污染物暴露对缺氧缺糖损伤的神经细胞毒性的影响，从而反应对缺血性脑卒中的影响。本发明体外模型操作简便、建模成功率高，所需样本量小，基于酶标仪的数据获得方便快速，具有重复性好等优点。

技术领域

本发明属于大气颗粒物毒性评价领域，涉及一种用于评估PM2.5暴露对缺血性脑卒中康复影响的细胞模型构建方法，通过建立一种新的细胞模型，基于分子生物学的方法用于评估PM2.5暴露对缺血性脑卒中康复的影响。

背景技术

空气污染是一种复杂的混合物，随着相关科研项目的展开，揭示了其所含的主要成分：颗粒物、臭氧、一氧化碳、氧化硫、氮、金、甲烷等，其中大气颗粒物(Particulatematter,PM)特别是直径小于2.5微米的颗粒物越来越被人们所熟知，根据空气动力学尺寸、气道解剖结构以及通气模式，吸入的颗粒物可以不同程度的在上呼吸道、导气管和肺泡等区域堆积，随着呼吸系统进入肺、心、嗅球等部位，引起机体各部位产生不同程度的炎症反应，还可随着血液循环破坏血脑屏障，作用于全身多个器官，目前认为其不仅对呼吸系统产生影响，对中枢神经系统也有不良影响，与脑卒中、帕金森、抑郁症等神经性疾病的发生息息相关。

近些年，脑卒中已经成为一种高度流行的疾病，是世界范围内第二大常见的死亡原因。此外，脑卒中也是导致成人长期神经功能障碍的主要原因。世界卒中组织最新疾病负担数据分析显示，全球范围内中风风险已上升至每4人中就有1 人可能患脑中风。为了探究大气污染颗粒物对缺血性脑卒中的影响，本实验建立了细胞氧糖剥夺共PM2.5染毒模型，从细胞活性、凋亡等方面研究PM2.5对氧糖剥夺损伤的神经细胞的影响，为探究颗粒物暴露缺血性卒中的发病风险和死亡率之间的关联提供有利的理论依据。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于评估PM2.5暴露对缺血性脑卒中康复影响的细胞模型构建方法，在细胞层面建立一种新的模型，评估 PM2.5暴露下对缺血性脑卒中康复的影响。首先采用自制的氧糖剥夺装置对神经细胞进行氧糖剥夺造模，其次用不同剂量的PM2.5对氧糖剥夺的细胞进行染毒建立氧糖剥夺共PM2.5染毒模型，用于评估外源污染物暴露对缺氧缺糖损伤的神经细胞毒性的影响，从而反应对缺血性脑卒中的影响。该方法具有价格低廉、操作简单、重复性好、造模成功率高等优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

步骤(1)：用TH-150C型智能颗粒物中流量采样器采集待检测环境的 PM2.5颗粒一定时间；

步骤(2)：制备PM2.5悬浊液；

步骤(3)：神经细胞PC12的培养

神经细胞PC12接种于培养瓶中，然后加入培养基进行重悬细胞，培养基体积为3ml，接种密度为1×10⁴个/瓶，在恒温CO₂培养箱中培养，待细胞覆盖培养瓶80％后得到培养好的神经细胞PC12；恒温CO₂培养箱的培养条件为37℃、 5％CO₂，培养时间为24h；

步骤(4)：利用氧糖剥夺装置对步骤(3)培养好的神经细胞PC12进行氧糖剥夺，同时加入步骤(2)不同浓度的PM2.5悬浊液进行染毒，建立细胞氧糖剥夺共PM2.5染毒模型；

步骤(5)：步骤4所得细胞样品，利用酶标仪，测定细胞毒性。

步骤(2)中制备PM2.5悬浊液的过程具体分为两步：

2-1将步骤(1)采集得到的粘附有PM2.5颗粒的滤膜浸入超纯水中，放在20-25℃下超声振荡处理60-80min，刮取滤膜表面的PM2.5颗粒，过滤，得到过滤后的悬浮液。