[发明专利]一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用

说明书

本发明属于减毒活疫苗技术领域，具体涉及一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用。该疫苗为将溶藻弧菌置于高浓度Mg²⁺环境中培养制得，无需再进一步进行灭活操作，直接对鱼类、虾类、蟹类进行免疫后，通过促进TCA循环，提高机体内的免疫基因的表达，进一步提高机体的免疫反应，抵抗溶藻弧菌对机体的侵害，显著提高生物的生存率；并且，本发明方法条件、制备步骤简单，非常适用于大规模产业化生产。

技术领域

本发明属于减毒活疫苗技术领域。更具体地，涉及一种溶藻弧菌减毒活疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为兼性厌氧菌，对营养要求不高，嗜盐，在17～35℃的适宜温度即可以生长繁殖，广泛分布于海水及河口中，数量居海水中各种弧菌之首。溶藻弧菌对海水鱼、虾及蟹类类的致病过程包括粘附、侵染、定居和繁殖，在海水鱼生长过程中进行侵染，对机体造成细胞、组织损伤，其代谢产物可以破坏机体局部或全身的正常代谢或机能，导致疾病的产生，一直被认为是许多海水鱼、虾及蟹类的重要致病菌，已经严重影响了水产养殖业的发展。

为了减少溶藻弧菌造成的病害，传统防治溶藻弧菌感染的方法主要有抗生素治疗、减毒或灭活疫苗、基因工程疫苗等。如中国专利申请CN103463645A公开了一种鱼类溶藻弧菌抗独特性抗体基因工程疫苗，该疫苗通过基因工程克隆出抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性；但是该方法需要采用基因工程的复杂方法，并且耗时耗力，成本较高。中国专利申请CN102296044A公开了一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，可以将其作为疫苗用于防治养殖鱼类中的溶藻弧菌病中；但是该方法采用的是较为特殊的野生低毒性溶藻弧菌，是偶然在自然环境中获取的，可遇不可求，较难实现大规模产业化生产，不利于实际情况对溶藻弧菌病害的防控与治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有基因工程技术复杂、耗时耗力且成本高；野生减毒突变株数量稀少且无法大规模生产和产业化应用的缺陷和不足，提供一种溶藻弧菌减毒活疫苗。

本发明的目的是提供所述溶藻弧菌减毒活疫苗的制备方法。

本发明另一目的是提供所述溶藻弧菌减毒活疫苗的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种溶藻弧菌减毒活疫苗的制备方法，将溶藻弧菌置于Mg²⁺浓度为100～400mM的环境中进行培养。

优选地，将溶藻弧菌置于Mg²⁺浓度为200～400mM的环境中进行培养。更优选地，将溶藻弧菌置于Mg²⁺浓度为200mM的环境中进行培养，在较低的Mg²⁺浓度条件下即可培养得到溶藻弧菌减毒活疫苗。

进一步地，所述Mg²⁺来自可溶性镁盐，所述可溶性镁盐为MgCl₂或MgSO₄。

优选地，具体的培养方法为：将溶藻弧菌ATCC33787单克隆接种于Yeast培养基中，并置于30℃摇床中200rpm震荡培养16小时，1:50转接于含有100～400mM MgCl₂的Yeast培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6，收集菌体待用。

另外的，本发明还提供了一种溶藻弧菌减毒活疫苗，由所述制备方法制备得到。

进一步地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗的使用剂量为2～6×10⁵CFU。

优选地，所述溶藻弧菌减毒活疫苗的剂量为2～4×10⁵CFU。

另外的，本发明还提供了所述溶藻弧菌减毒活疫苗在制备防治溶藻弧菌病害制剂中的应用。