[发明专利]一种肺炎克雷伯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种肺炎克雷伯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在肺炎克雷伯菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑9的标记位点；所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定肺炎克雷伯菌并精细的区分不同的亚型；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏和免培养的检测优势，可应用于大规模样本的肺炎克雷伯菌的鉴定和遗传变异检测，对肺炎克雷伯菌的科研、退化监测具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种肺炎克雷伯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)是自然界常在的菌，属条件致病菌，它会引起肺炎、伤口感染和泌尿道等疾病，在糖尿病患者、肿瘤患者、婴儿、长期使用抗生素的病人中发病率高。此外，肺炎克雷伯菌也是造成无特定病原体动物污染的主要微生物之一。当实验动物如大、小鼠，在机体免疫功能下降或处于应激状态时，常因感染肺炎克雷伯菌而影响其质量及干扰动物实验，甚至引起动物死亡而造成实验数据和经济上的损失，严重影响到教学及科学研究。肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌另外，肺炎克雷伯菌也是实验室进行研究常用的模式病原微生物。其作为群体生物，在和宿主、环境的互作中，群体内个体会发生变异。对于实验室的研究来说，这种不易被察觉的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人Hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。因此，开发快速、准确的、可监测变异的肺炎克雷伯菌检测分析方法对于肺炎克雷伯菌的科学研究和应用都具有重要意义。

经典的肺炎克雷伯菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组的分离培养步骤和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音，具有免培养、样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异的优势。

现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。

因此，开发病原微生物肺炎克雷伯菌的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种肺炎克雷伯菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对肺炎克雷伯菌进行定性鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种肺炎克雷伯菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在肺炎克雷伯菌基因组上筛选的物种特异的、且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括CP003200基因组上MNP-1～MNP-9的标记位点。

上述技术方案中，MNP-1～MNP-9的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于CP003200序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括9对引物，所述9对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQID NO.18所示。

上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。