[发明专利]一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用

权利要求书

1.一种游离型表达载体，其特征在于，所述表达载体为：在pMD19-T Vector骨架上依次整合了目的基因表达盒、乳酸克鲁维酵母的自主复制序列PanARS、筛选标记基因表达盒、毕赤酵母的自主复制序列PPARS2；

所述乳酸克鲁维酵母的自主复制序列PanARS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述毕赤酵母的自主复制序列PPARS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、目的基因插入酶切位点、转录终止子；所述启动子为渗透压诱导的GAP启动子、GPD启动子、STL3启动子、酸诱导的GMT启动子和高温诱导的CWP1启动子中的任一种。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述GPD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述STL3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述GMT启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述CWP1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.如权利要求1～3任一所述的表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因为产甘油假丝酵母的URA5基因，所述筛选标记基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.携带权利要求1～4任一所述表达载体的重组细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以产甘油假丝酵母为表达宿主。

7.一种利用产甘油假丝酵母制备目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法为，将目的蛋白的基因插入权利要求1～4任一所述的表达载体的目的基因插入酶切位点，得到重组载体，将重组载体转化至产甘油假丝酵母中进行表达制备得到目的蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白，4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶、NADPH-黄素氧化还原酶、酪氨酸氨裂合酶。

9.一种重组产甘油假丝酵母，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述的表达载体，表达了4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶、NADPH-黄素氧化还原酶、酪氨酸氨裂合酶。

10.权利要求1～4任一所述的表达载体在产甘油假丝酵母表达外源蛋白中的应用。