[发明专利]一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用

说明书

本发明公开了一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用，属于酵母基因工程领域。本发明的表达载体采用双ARS大幅度提高了质粒自我复制性能；该游离表达载体的开放阅读框可采用产甘油假丝酵母中的内源启动子和可提高质粒性能的内源AOX1终止子；该游离表达载体的筛选标记为产甘油假丝酵母的URA5基因；该游离表达载体属穿梭质粒，还含有来自克隆载体的氨苄青霉素抗性基因以及原核生物复制原点；该表达载体首次实现了在产甘油假丝酵母中进行游离自主复制，并可应用于各种基因的游离表达。

技术领域

本发明涉及一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用，属于酵母基因工程领域。

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是从自然界中筛选分离出来的一株能够在超高渗透压(55％葡萄糖，W/V)下进行快速生长的可高产甘油的工业生产的安全菌株，与模式菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相比，产甘油假丝酵母生长能力极强并且具备更高的酸胁迫，高温，高渗透压，高氧化压力等耐受性，除此外，其对许多物质等耐受性在酵母中也是出类拔萃(如10％乙醇、8％乳酸、4.5g/L苯乙醇和＞200g/L柠檬酸)，显而易见其拥有相当重要的研究价值。

游离表达的载体是表达异源基因很好的选择，其已广泛用于基础研究和合成生物学应用。酵母质粒又分为整合质粒，附加体质粒，复制质粒以及稳定质粒。对于整合质粒，其无法在菌体内进行自我复制，只能通过整合到菌体细胞基因组上借助染色体的复制机制才能进行稳定的表达；对于附加体质粒，含有酿酒酵母天然2μ质粒部分片段(复制起始部位和rep基因)或全部片段，并可在酿酒酵母中持续存在；对于复制质粒，其含有酵母DNA的自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS)，而ARS序列是在DNA复制中的每个细胞周期的S期仅启动一次的基因组位点，从而使其能在真核细胞中独立于染色体外进行自主的复制；对于稳定质粒，在复制质粒基础之上再向插入酵母着丝粒的一个DNA片段，使其具有两个特征序列：自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(centromere DNA sequence,CEN)，CEN序列使其能够均分到子细胞中。

不论是作为模式菌株的酿酒酵母还是其他非常规酵母，绝大部分都已经含有可在自身进行游离表达的载体，然而，因为在产甘油假丝酵母中也并未发现天然的游离质粒，也未找到合适的游离表达载体，所以在产甘油假丝酵母中对目的基因的表达还仅限于操作十分复杂并且低拷贝的整合载体进行表达的方式，这种缺陷严重的限制了对其的分子改造、育种和研究，为了弥补产甘油假丝酵母在分子生物学改造、育种和研究技术上的短板，研发一种能在产甘油假丝酵母中游离表达的载体迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种可在产甘油假丝酵母中游离表达各种基因的双ARS载体，该游离表达质粒可在无天然游离质粒的工业生产安全菌株产甘油假丝酵母中进行自主复制并用于各种目的基因的表达。

本发明提供了一种游离型表达载体，所述表达载体包括：

pMD19-T Vector骨架、目的基因表达盒、乳酸克鲁维的自主复制序列PanARS、筛选标记基因表达盒、毕赤酵母的自主复制序列PPARS2；

所述乳酸克鲁维酵母的自主复制序列PanARS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述毕赤酵母的自主复制序列PPARS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、目的基因插入酶切位点、转录终止子；所述启动子包括是渗透压诱导的GAP启动子、GPD启动子、STL3启动子、酸诱导的GMT启动子和高温诱导的CWP1启动子中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，所述TRP1终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。