[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法有效
| 申请号： | 202111463993.2 | 申请日： | 2021-12-02 |
| 公开（公告）号： | CN114134218B | 公开（公告）日： | 2022-10-28 |
| 发明（设计）人： | 李振军;邱小彤;刘雪萍;徐帅 | 申请（专利权）人： | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12N15/113;C12N9/22 |
| 代理公司： | 北京市众天律师事务所 11478 | 代理人： | 李新军 |
| 地址： | 102206 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr cas12a 荧光 检测 方法 | ||
1.一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以盖尔森基兴诺卡菌的基因组中protein_id为VFA97995.1的蛋白质的编码基因为靶基因进行聚合酶链扩增反应；
(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应，其中，crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ IDNO.4所示，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为60-65℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为65℃。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述荧光强度的检测为实时荧光定量检测方法。
7.一种用于权利要求1所述方法的核酸分子组合，其特征在于，所述核酸分子组合包括：序列如SEQ ID NO.1所示的聚合酶链扩增反应上游引物，序列如SEQ ID NO.2所示的聚合酶链扩增反应下游引物，序列如SEQ ID NO.3所示的crRNA分子。
8.一种含有权利要求7所述核酸分子组合的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
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