[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的荧光检测方法及应用，所述方法将PCR扩增与CRISPR‑Cas12a荧光检测相结合以检测盖尔森基兴诺卡菌，通过PCR扩增目的DNA片段，利用Cas12a蛋白的反式切割活性，实现CRISPR‑Cas12a的特异性荧光检测。该检测平台可用于鉴定盖尔森基兴诺卡菌，具有检测快速、灵敏度和特异性高的特点。

技术领域

本发明公开了一种基于CRISPR-Cas12a与PCR相结合检测病原体核酸的方法，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

诺卡氏菌是一种机会致病菌，可导致几乎所有器官的严重感染，包括创伤性感染、肺部疾病和脑脓肿。近年来，在免疫功能低下的患者中，诺卡氏菌的感染显著增加，包括艾滋病晚期、糖尿病患者和器官移植患者等。盖尔森基兴诺卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)越来越成为一种常见的诺卡氏菌感染病原体。由于诺卡氏菌种间序列高度相似，传统的分离培养和生化试验难以将诺卡氏菌鉴定到种水平，而诺卡氏菌不同的种具有不同的抗菌药物耐药模式，因此，迫切需要一种快速、特异的检测方法鉴定盖尔森基兴诺卡菌，指导临床早期合理用药。

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas蛋白)组成的CRISPR-Cas系统是细菌或古细菌体内的一种获得性免疫系统。CRISPR-Cas系统不仅可用于基因编辑，也可用于病原体的核酸检测。Cas12a蛋白具有反式切割活性，Cas12a蛋白在crRNA的引导下特异性地与靶向双链DNA(dsDNA)结合并激活其反式切割活性，不加区别的切割非特异性单链DNA(ssDNA)，通过在ssDNA两端修饰荧光基团和猝灭基团，当ssDNA探针裂解后会发出荧光信号，因此CRISPR-Cas12a系统可作为核酸检测的工具。DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)是基于CRISPR-Cas12a建立的一种核酸检测方法，特异性地鉴别人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型。CRISPR-Cas12a荧光检测方法通过设计不同的crRNA序列，指导Cas12a蛋白结合不同的靶向dsDNA序列，可用于不同病原体的检测。

基于现有技术存在的问题，本发明的目的就是建立一种将聚合酶链扩增反应(PCR)与CRISPR-Cas12a检测相结合的核酸检测方法，并将其用于诺卡氏菌的检测。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以盖尔森基兴诺卡菌的基因组中protein_id为VFA97995.1的蛋白质的编码基因为靶基因进行聚合酶链扩增反应(PCR)；

(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应，其中，crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

本发明提供的方法将PCR扩增和CRISPR-Cas12a荧光检测相结合，被命名为“CRISPR-PCR”，所述引物和探针是基于盖尔森基兴诺卡菌的蛋白质protein_id:VFA97995.1编码基因设计的，盖尔森基兴诺卡菌全基因组Accession:LR21597.3，蛋白质protein_id:VFA97995.1的编码基因位于1870620-1871693bp之间，由本申请人命名为Ncc1基因。本发明提供的方法可用于检测盖尔森基兴诺卡菌。所述方法首先根据PCR引物，扩增目的DNA片段；然后根据保守序列设计特异性crRNA，引导Cas12a蛋白与靶向dsDNA结合，以实现盖尔森基兴诺卡菌的检测。