[发明专利]Akt1磷酸化PMS2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种Akt1磷酸化PMS2蛋白在作为卵巢癌治疗靶点中的应用，所述鉴定Akt1磷酸化PMS2蛋白作为卵巢癌治疗靶点的方法包括：通过Western Blot检测活化Akt1和p‑PMS2关系；检测p‑PMS2 T156下调后卵巢癌细胞迁移能力的变化；检测p‑PMS2 T156下调后卵巢癌细胞侵袭能力的变化；通过平板克隆法检测转染PMS2‑T156A后卵巢癌细胞克隆形成能力的变化；通过流式细胞仪及Western Blot检测转染PMS2‑T156A卵巢癌细胞凋亡的影响。本发明首次证实Akt1磷酸化PMS2 156位点的苏氨酸，为卵巢癌研究和治疗提供一个新的方向及靶点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种Akt1磷酸化PMS2蛋白在作为卵 巢癌治疗靶点中的应用。

背景技术

目前，卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，其中上皮性卵巢癌约占 85～90％。由于其早期临床症状不明显，且缺少早期诊断方法，大多数确诊时已 属晚期。据报道2014年，美国新发卵巢癌病例为21980例，死亡病例为14270 例，约2/3的新发病例发现时已是FIGOIII-IV，即已有骨盆外转移。目前卵巢癌 临床治疗金标准是肿瘤细胞减灭术联合以铂为基础的化疗治疗，尽管大多数患 者初次治疗时对化疗反应好，仍有部分患者短期内复发，5年生存率仅不到30％。 目前，早期诊断困难和化疗耐药是影响卵巢癌治疗效果和预后差的主要原因。 因此寻求卵巢癌治疗新靶点、提高卵巢癌疗效，成为当前研究的热点。

Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称蛋白激酶B(protien kinase B，PKB)， 含3种异构体Akt1，Akt2和Akt3，也称为PKBα，PKBβ和PKBγ。它们有相同 的结构，但编码于不同的染色体上并且生物学功能差异很大。其中Akt1分布组 织广泛且在细胞生长和存活中有重要作用；Akt2主要在肌肉和脂肪组织中高表 达，它的作用主要是通过胰岛素调节葡萄糖稳定；Akt3表达仅局限在睾丸和脑 组织中。Akt可通过磷酸化多种底物调节细胞活动如生长、增殖、抗凋亡损伤、 控制DNA损伤应答和基因稳定性、代谢、转移和肿瘤发生。已发现，Akt异常 与多种肿瘤相关，如乳腺癌，结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、胰 腺癌、肝细胞癌等。另外，在多种细胞系中发现顺铂作用后Akt活化导致顺铂 耐药性增加。活化的Akt1可以识别和磷酸化靶蛋白中的共有基序RXRXX(S/T) 发挥相应的生物学下游。

DNA错配修复(MMR)是从细菌到人类所有物种中一高度保守的维持基因 组稳定性的系统。它的主要功能是在合成DNA时，通过特异性链去除错配碱基 和插入/缺失错配以确保复制保真性。MMR基因胚系突变可导致Lynch综合征 (LS)发生，一种常染色体显性遗传病，具有发展为其他恶性肿瘤的高风险。 MMR蛋白缺乏可增加个体易癌性，如结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌等。 研究发现MMR影响了多种细胞过程，如DNA损伤信号，凋亡，有丝分裂和减 数分裂重组，类别转换重组，体细胞超突变和三联体扩张。PMS2是MMR其中 一员，目前研究其失衡与LS，乳腺癌，前列腺癌，鼻咽癌，儿童癌症综合征， 血液系统肿瘤等多种癌症的发生有关。但现有技术中关于验证Akt1磷酸化PMS2 蛋白能否作为卵巢癌治疗靶点的技术方案尚未见报导。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于验证Akt1 磷酸化PMS2蛋白能否作为卵巢癌治疗靶点的技术方案尚未见报导。

解决以上问题及缺陷的难度为：前期研究发现卵巢癌中PMS2的表达与磷 酸化GSK-3β(p-GSK-3β)呈负相关，免疫共沉淀发现GSK-3β和PMS2能 够相互结合，提示GSK-3β可通过磷酸化PMS2影响其稳定性，但受限于PMS2 磷酸化位点不清楚，国内外没有厂商进行相关研究及相关磷酸化位点的抗体制 备，导致不能进一步证实其确切的作用机制。通过软件发现，PMS2上存在Akt1 磷酸化的共有基序RXRXX(S/T)，并且发现活化的Akt1(p-Akt S473)与PMS2 蛋白表达呈负相关，且CO-IP发现两者可以直接结合，断定其存在相互作用位 点，结合蛋白结构学，最终选择了PMS2156苏氨酸位点，需要后续大量实验验 证。