[发明专利]一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一种重组大肠杆菌，其基于细胞膜改造提高大肠杆菌抗逆性和产物合成性能，具体通过导入表达了来自谷氨酸棒杆菌的氧化应激调节酶的基因whiB (NCBI ID:AKL15_01645)与来自铜绿假单胞菌的不饱和脂肪酸顺反异构酶的基因cti（NCBI ID:CWI20_17990）来实现。本发明的重组菌株可以在厌氧条件下耐受高浓度底物与产物的抑制，同时可以在5L发酵罐厌氧条件下，提升菌株生长量与丁二酸积累。

技术领域

本发明属于生物工程及其发酵技术领域，一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸不仅是TCA循环的中间产物，而且是厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中具有非常重要的作用。且丁二酸及其衍生物应用广泛，可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃以及聚丁二酸丁二醇酌(PBS)类生物可降解聚酯，在食品、医药、印刷等各个行业应用广泛。近年来，随着化石资源利用与环境保护的冲突日益严重，采用生物法制备丁二酸符合绿色、可再生等环境友好型生产规定，前景广阔。

相比传统化学合成法工艺复杂、条件苛刻、依赖石油等缺点，生物法具有原料价格低廉、污染小等优势。但是，发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，只有部分菌株可产高浓度的丁二酸。且生物合成法需要不断优化合成路径、改造工程菌株以达到工业化高产高效的目的。其中Escherichia coli由于遗传背景清楚，基因改造简单，生长速度快以及所用培养基简单廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。

由于在菌株发酵过程中产物的不断积累，需要加碱调节pH来维持菌体的最适生长。但在发酵后期，菌株的生长仍受到较大抑制，高浓度底物与高浓度产物带来的抑制不能被碱液调节所完全缓解。因此，提升菌株的抗逆性能成为了一个新的突破口。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种重组大肠杆菌及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其导入了表达来自谷氨酸棒杆菌的其导入了表达来自谷氨酸棒杆菌的氧化应激调节酶的基因whiB(NCBI ID:AKL15_01645)与来自铜绿假单胞菌的不饱和脂肪酸顺反异构酶的基因cti(NCBI ID:CWI20_17990)，其中，基因WhiB的序列号为NCBI ID:AKL15_01645；基因cti的序列号为NCBI ID:CWI20_17990；所述宿主菌为保藏号为CCTCCNO：M2012351的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BER208。所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BER208的保藏日期为2012年9月14日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，其详细内容披露于专利CN102864113A中。

本发明进一步提出了上述重组大肠杆菌的构建方法，通过将表达来自谷氨酸棒杆菌的氧化应激调节酶的基因whiB与来自铜绿假单胞菌的不饱和脂肪酸顺反异构酶的基因cti构建到保藏号为CCTCCNO：M2012351的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BER208中得到。

具体地，构建方法包括如下步骤：

(1)目的基因片段whiB和cti的获得；

(2)使用一步克隆法将目的基因片段克隆至出发质粒上，得到重组质粒；

(3)将测序正确的阳性克隆质粒转化入宿主菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BER208中，再通过Amp抗性筛选得到所述抗逆性能提升的产丁二酸的重组大肠杆菌。

优选地，所述出发质粒为pTrc99A质粒。