[发明专利]濒危半红树植物莲叶桐SSR引物及其应用

说明书

本发明属于分子遗传学领域，公开了基于SSR分子开发的海南岛莲叶桐居群遗传多样性和遗传结构分析等方面的应用，分析莲叶桐不同群体遗传结构特征和群体遗传多样性，明晰不同群体之间的基因交流和遗传分化程度，阐明濒危半红树植物莲叶桐居群的系统进化和地理分化，为濒危半红树植物莲叶桐分子生物学和遗传学研究奠定基础，对莲叶桐遗传多样性的保护和资源有效利用等提供理论基础。采用本发明转录组高通量技术开发的SSR标记，速度快，效率高，成本低。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及SSR引物，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐的特异性SSR引物。

背景技术

莲叶桐(Hernandia nymphaeifolia(J.Presl)Kubitzki)是莲叶桐科、莲叶桐属常绿乔木，因含木质素和生物碱而具有一定的药用价值。目前针对正处于濒危状态的莲叶桐的研究在国内外都较为少见。刘梨萍、吴银生等对莲叶桐树枝和种子成分进行了研究，发现其中含有多种抗肿瘤和白血病等疾病的物质，验证其重要的药用价值。李佳文等进行了莲叶桐与其近缘物种的对比进化聚类分析，将其归为樟目，还验证了莲叶桐的叶绿体基因组之间具有高度保守性，为莲叶桐的系统进化提供了新的证据。周婉敏，刘楠等对莲叶桐在热带珊瑚岛环境的生理生态适应性进行了探究。尚未有人提出对濒危植物莲叶桐的遗传特征与濒危机制以及应对策略。目前没有应用SSR分子标记设计引物研究莲叶桐的遗传多样性。

SSR即简单序列重复(simple sequence repeat)，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)或短串联重复序列(short tandem repeat,STR)，是一类由2至6个核苷酸为重复单位的串联而成的简单序列，长度一般在几十个核苷酸左右，其两端序列是相对保守和特异的单拷贝序列。在漫长的进化过程中，生物体内部的核苷酸之间会发生不相等的交换，从而可以渐渐积累出重复频次不同的碱基，并且在不同的生物体内部，即使是在同一微卫星位点，其重复单位的数目也不一定会一样，这就是致使微卫星位点发生突变并可以展现出多态性的原因，这样的突变于生物体本身来说是微弱的，通常不对生物体本身表现出明显的危害，因此生物体内染色体存在十分丰富的微卫星变异。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供莲叶桐的特异性SSR引物，应用于研究莲叶桐在海南岛不同居群的遗传多样性，分析该物种不同居群遗传结构特征和居群遗传多样性，明晰不同居群遗传分化和基因交流状况以及群体系统发育与进化关系，从而分析莲叶桐的濒危机制，结果将对濒危半红树植物莲叶桐的资源保护与开发有重要意义；此外有助于提出相应的保护和恢复措施,这对保护生物多样性以及维持生态平衡具有十分重要的理论和实践意义。

本发明的技术方案为：濒危半红树植物莲叶桐特异性SSR引物，包括如下引物物对：

同时，本发明还提供所述的特异性SSR引物在来自海南岛10个代表居群共46个莲叶桐样本居群遗传多样性分析、遗传分化分析或遗传结构分析中的应用。

进一步地，所述的应用包括如下步骤：

(1)提取莲叶桐基因组DNA

(2)利用权力要求1所述的特异性SSR引物进行荧光PCR扩增；

(3)使用毛细管电泳等方法检验扩增产物，获得检测结果；

(4)利用步骤(3)的结果进行莲叶桐居群遗传多样性分析、遗传分化分析或遗传结构分析。

所述的应用，其PCR的反应体系如下：

所述PCR的扩增程序如下：

利用本发明的特异性SSR引物开发了试剂盒，该试剂盒含有本发明的特异性SSR引物。