[发明专利]基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用

权利要求书

1.一种基于氨基酸改造的新型减毒单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除编码溶血素LLO蛋白的hly基因中第251-255位氨基酸后获得。

2.一种减毒菌株，其特征在于，含有权利要求1所述的减毒单核细胞增多性李斯特菌；该减毒菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单核增生李斯特氏菌，Listeria monocytogenes.LAPD5155；保藏编号为CGMCC NO：23599。

3.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗外源抗原递呈载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。

4.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒pSL2424；

(2)以单増李斯特菌野生株制备WT感受态细胞；

(3)利用步骤(1)制备的重组质粒对步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；

(4)以单増李斯特菌野生株与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)以单増李斯特菌野生株的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取hly基因中的第87-250位氨基酸作为上游同源臂、选取hly基因中的第256-422位氨基酸作为下游同源臂；设计引物扩增上游同源臂和下游同源臂，条带大小分别为501bp和499bp，作为片段A和片段B；

(1.2)利用重叠PCR技术将两个片段连在一起，获得A-B目的片段；

(1.3)以BamH I和Pst I为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL2424。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

将单増李斯特菌野生株接种于新鲜无菌的BHI液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀ nm值为0.18-0.25；加入青霉素G，使其终浓度为20μg/mL，37℃振荡培养2h；离心后收集菌体，加入适量洗涤缓冲液，洗涤两次；离心弃上清，向沉淀中加入洗涤缓冲液，重悬菌体以获得感受态细胞；分装，置于-80℃冰箱备用。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：

将步骤(1)所得重组质粒电转入步骤(2)所得单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的含0.5M蔗糖的BHI液体培养基，充分混匀，置30℃恒温培养箱2-3h；离心，将上清重悬菌液均匀涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置37℃培养，得到单克隆菌落。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：

挑取步骤(3)中经电转化获得的单克隆菌落，在氯霉素抗性的BHI液体培养基扩大培养，进行PCR验证；将阳性菌株置于42℃进行同源重组，以及30℃连续传代丢失质粒，最后进行PCR筛选和基因测序验证，得到重组减毒单増李斯特菌；将测序正确的菌液和60％甘油体积比1:1混合，置-80℃冰箱保存。