[发明专利]基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，旨在提供一种基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用。该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除hly基因中第251‑255位氨基酸后获得。本发明提供了含有该减毒单核细胞增多性李斯特菌的减毒菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的单増李斯特菌的减毒株可作为外源抗原递送活载体用于肿瘤等疾病的免疫治疗或免疫佐剂。由于是在李斯特菌基因组上进行敲除修饰，不含抗性质粒等生物标记，符合生物安全，且不影响李斯特菌体外生长。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种单核细胞增多性李斯特菌，具体来说是一种新型的单核细胞增多性李斯特菌，因毒力致弱，可用于递送表达外源抗原，用作免疫疗法的活疫苗载体。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性胞内寄生病原菌。李斯特菌有着极强的生存能力且广泛分布于各种环境中，能够在许多不同的环境中持续生存，极易感染免疫力低下的人群，造成细菌性败血症、胃肠炎、脑膜炎以及流产等李斯特菌病。

近年来，科研界通过对李斯特菌的研究发现，其可作为一种有前景的疫苗载体，呈递肿瘤相关抗原，并且在人乳头瘤病毒、前列腺癌、黑色素瘤、转移性乳腺癌等方面都有着不错的成效。减毒活载体疫苗的特点是能引起较强的免疫反应，由于单増李斯特菌能在巨噬细胞内增殖，其能够更好的递呈抗原。除此之外，已知单増李斯特菌LLO能够增强抗原的特异性免疫反应。

但是，传统的减毒策略主要是毒力基因的敲除、质粒回补等，存在对机体安全性不够、免疫原性低、抗原呈递效率不高等局限性。因此，本发明的减毒策略以及获得的减毒活载体疫苗致力于有效解决传统疫苗面临的技术缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

提供一种基于氨基酸改造的新型减毒单核细胞增多性李斯特菌，该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除hly基因(编码溶血素LLO蛋白)中第251-255位氨基酸(FKQIY)后获得。

本发明进一步提供了一种减毒菌株，含有前述的减毒单核细胞增多性李斯特菌；该减毒菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为单核增生李斯特氏菌，Listeria monocytogenes.LAPD5155；保藏编号为CGMCC NO：23599。

本发明还提供了前述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗外源抗原递呈载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。因毒力致弱，可作为外源抗原递送活载体用于肿瘤等疾病的免疫防治。

本发明进一步提供了前述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒pSL2424；

(2)以单増李斯特菌野生株制备WT感受态细胞；

(3)利用步骤(1)制备的重组质粒对步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；

(4)以单増李斯特菌野生株与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。

作为优选方案，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)以单増李斯特菌野生株的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取hly基因中的第87-250位氨基酸作为上游同源臂、选取hly基因中的第256-422位氨基酸作为下游同源臂；设计引物扩增上游同源臂和下游同源臂，条带大小分别为501bp和499bp，作为片段A和片段B；

(1.2)利用重叠PCR技术(SOE-PCR)将两个片段连在一起，获得A-B目的片段；