[发明专利]一种基因甲基化检测引物组合物及其试剂盒和应用

权利要求书

1.一种基因甲基化检测引物组合物，其特征在于：所述的基因包括PAX8、RASSF1及SFRP2基因；

所述的检测PAX8的引物组合物包括：

扩增PAX8基因的特异性引物：

PAX8-F:5'-GGGGGTTAGGGGATTTTGATTATA-3'；

PAX8-R:Biotin-TCCRAAATAATCCCATCCAAC；

焦磷酸测序引物：PAX8-S:5'-ATGGAGTTGTGAGGT-3'；

所述的检测RASSF1的引物组合物包括：

扩增RASSF1基因的特异性引物：

RASSF1-F:5'-TTTATTTATTGGGTGGGGTAGGA-3'；

RASSF1-R:Biotin-5'-CCTCAAAATCACCATCCAACCTCTAC-3'；

焦磷酸测序引物：RASSF1-S:5'-GGGAGATAGGTTAGTAGTTTTA-3'；

所述的检测SFRP2的引物组合物包括：

扩增SFRP2基因的特异性引物：

SFRP2-F:5'-GATTAGGGATAATTAGGTAAAAGGAGTT-3'；

SFRP2-R:Biotin-5'-ATTCATCCCCTACCTACCAAAAAACACC-3'；

焦磷酸测序引物：SFRP2-S:5'-AGTTAGAGATATTAGATTTTAGG-3'。

2.权利要求1所述的引物组合物在制备肿瘤检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤包括结肠癌、直肠癌、胃癌。

4.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、亚硫酸氢盐处理试剂、PCR扩增体系、PCR产物的单链纯化试剂、焦磷酸测序试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

所述的核酸提取试剂包括粪便悬浮液；

所述亚硫酸氢盐处理试剂包括10mM氢醌溶液和3.6mol/L NaHSO₃；

所述的PCR扩增体系还包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和纯水；

所述的单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70％(V/V)乙醇、变性液、1×WashBuffer、结合缓冲液、退火缓冲液；

所述的测序试剂还包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。

7.一种检测PAX8、RASSF1及SFRP2基因甲基化的方法，所述的方法为非疾病诊断或治疗方法，其特征在于：所述的方法包括利用权利要求1所述的引物组合物或权利要求4-6所述的试剂盒采用焦磷酸测序对样本进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：

(1)收集人源样本，提取样本中人源DNA；

(2)将提纯的DNA进行亚硫酸氢盐处理；

(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用本发明所述引物PAX8-F和PAX8-R扩增PAX8基因片段，同时使用引物RASSF1-F和RASSF1-R扩增RASSF1基因片段，同时使用引物SFRP2-F和SFRP2-R扩增SFRP2基因片段，获得PCR扩增产物；

(4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功；

(5)若步骤(4)中扩增成功，则进行单链纯化；

(6)利用焦磷酸测序引物SFRP2-S、RASSF1-S及SFRP2-S对步骤(5)中的单链纯化产物进行测序；

(7)根据步骤(6)中的焦磷酸测序结果，得到每个CG位点的甲基化改变情况及发生频率。