[发明专利]一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法

说明书

本发明公开了一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法，使用培养基液体量少，每孔仅90ul，1个96孔板可以同时监测多个噬菌体与被试验细菌相互作用的高通量试验。微量培养液中噬菌体与被加四唑类染料的试验细菌的混合液借助OmniLog TM系统的设计，即依赖于氧化还原化学，采用细胞呼吸作为通用报告器，通过四唑类染料的颜色变化来自动测量细菌生长情况。OmniLog TM系统，具有微量、快速、灵敏和准确等优点，与传统的噬菌体试验相比，该系统在整个试验过程中实时、连续监测和自动化监测噬菌体感染和细菌生长方面具有明显的优势，在鼠疫噬菌体分离、宿主谱鉴定、生物学特性鉴定等研究工作中具有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及病原微生物技术领域，具体涉及一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法。

背景技术

鼠疫噬菌体作为鼠疫菌的细菌病毒，广泛存在于自然界。它是具有严格寄生性的细菌病毒，吸附在菌细胞上，必须在活的易感的菌细胞内生长繁殖，并能将宿主细胞裂解。噬菌体侵染细菌的感染期、增殖期和成熟期中都有许多噬菌体的特异性变化。这些变化的试验步骤通常用液体检测法和半固体培养法测定。

其中，液体检测法通常监测细菌培养物在感染、生长和被噬菌体裂解后细菌培养物的光密度降低情况，从而可以间接测定噬菌体的裂解活性，液体鉴定鼠疫噬菌体宿主谱所需培养液体积总量不于5ml，但是裂解产生的细菌细胞碎片可能升高光密度值，从而掩盖或低估了真正的噬菌体裂解活性。另外传统的一夜噬菌体生长实验会给人错误的印象，因为过夜培养后培养液的混浊误认为是使其不能裂解，而实际上噬菌体在细菌生长形成之前就已完全裂解。半固体培养法包括交叉条带试验、点滴法和空斑计数法，其中空斑计数法能够定量噬菌体对其宿主细菌的裂解活性。但是在目前的噬菌体研究中发现部分野生型鼠疫噬菌体能够使含有细菌培养物的培养液光密度降低，但是在半固体培养基上不能形成噬菌斑，这并不一定意味着噬菌体缺乏生产性感染。半固体培养基制备程序复杂，一个平皿中既要倒好底层培养基，又要在后期试验中熔解凝固的上层培养基，还要等温度适当的时间噬菌体与被检测菌加入其中，使其凝固后移至培养箱。上述平皿仅验证1株噬菌体对应1株被检菌。

综上所述，液体检测法和半固体培养法两种检测方法费力、耗时且昂贵，尤其是在需要同时监测多个噬菌体-细菌相互作用的高通量试验中是不切实际的。

发明内容

基于上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法。

本发明保护一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法，具体步骤包括如下：

步骤1，将分离的野生型鼠疫噬菌体纯化，使其增殖，根据野生型鼠疫噬菌体的生长条件选择液体检测法或者半固体培养法测定效价，使其效价达10⁶以上，备用；

步骤2，选取实验用鼠疫菌/非鼠疫菌拟作为宿主菌，勾取菌苔于新鲜LB液体培养基中，置于28℃空气浴振荡培养箱，120r/min振荡培养18～20h至对数生长期备用；在加入无菌96孔微量培养板之前菌悬液中加入四唑类染料，使四唑类染料最终浓度为20％；

步骤3，无菌96孔微量培养板的第1列孔中分别加入步骤1增殖后的100ul野生型鼠疫噬菌体，根据野生型鼠疫噬菌体效价，自由确定向第2至5列孔各孔中分别加入90ul LB液体培养基进行稀释；

步骤4，从第1列试验孔中分别取10ul野生型鼠疫噬菌体加入第2列试验孔中，用LB液体培养基作为稀释液进行10倍稀释，相同倍数依次稀释至第5列试验孔，第5列试验孔液体混匀后弃去10ul稀释液；

步骤5，取步骤2含四唑类染料的菌悬液10ul，分别加入无菌96孔微量培养板的每行第1-6列试验孔中，每行中添加有1株实验用鼠疫菌或非鼠疫菌；