[发明专利]一种非人哺乳动物人工辅助生殖方法

说明书

本发明提供了一种非人哺乳动物人工辅助生殖方法。本发明的方法包括以非人哺乳动物卵母细胞膜电位值X判定体外成熟非人哺乳动物卵母细胞质量。实验发现不同膜电位非人哺乳动物卵母细胞，其后续发育潜能具有显著性差异，因此推断，非人哺乳动物卵母细胞成熟后膜电位与非人哺乳动物卵母细胞成熟质量及后续发育潜能具有相关性，成熟后非人哺乳动物卵母细胞的膜电位可以作为非人哺乳动物卵母细胞成熟质量及后续发育潜能的一个重要判定指标。膜电位数值为负值，且在‑30～‑10 mV之间的牛卵母细胞，质量最好，后续受精发育和核移植胚胎发育率最高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种非人哺乳动物人工辅助生殖方法。

背景技术

非人哺乳动物卵母细胞体外培养的成熟是动物人工辅助生殖技术中非常重要一个技术环节，随着体外受精、核移植等胚胎工程技术的研究和应用越来越广泛，非人哺乳动物卵母细胞体外培育的质量是决定胚胎生物工程研究和应用成败的关键前提因素之一。

在合子形成过程中，精子和卵细胞都提供了遗传物质。除此之外，卵细胞还为早期胚胎的发育提供了大量必需的营养物质。因而，作为受精卵发育基础，非人哺乳动物卵母细胞质量的高低直接关系到合子发育甚至是新生个体一生的命运。大量的试验研究也表明，非人哺乳动物卵母细胞质量的好坏将直接影响卵细胞的受精率、受精卵的卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和维持、胎儿的发育，甚至成年后的健康问题。选择高质量非人哺乳动物卵母细胞对于辅助生殖及体细胞克隆等技术来说至关重要，而如何来评价非人哺乳动物卵母细胞的质量则成了辅助生殖技术领域及繁殖科学面临的一个关键问题之一。

长期以来，评价非人哺乳动物卵母细胞质量的标准是形态学指标。90年代中期，评价非人哺乳动物卵母细胞的质量除了形态学指标以外，附以体外发育（培养）、差异性细胞染色、荧光代谢探针、胚胎代谢的显微分析等评价方法。到目前为止，判断非人哺乳动物卵母细胞及早期胚胎质量的标准仍然以形态学指标为主。实践证明，这一指标是不可靠的。因为，形态正常的卵及胚胎经过移植以后并非都能得到较高的成活率。这说明形态学指标在评价非人哺乳动物卵母细胞及早期胚胎质量方面的局限性。近年来的研究表明，在非人哺乳动物卵母细胞的发育过程中非人哺乳动物卵母细胞的膜起着至关重要的作用，随着非人哺乳动物卵母细胞的发育，非人哺乳动物卵母细胞的膜电位也随之而自发变化。大量实验证明，非人哺乳动物卵母细胞成熟与排卵和卵泡细胞膜电位密切相关，非人哺乳动物卵母细胞成熟后，非人哺乳动物卵母细胞膜去极化，阻断非人哺乳动物卵母细胞的成熟， 去极化也相应消失。因此， 膜电位是非人哺乳动物卵母细胞成熟和受精的电生理学标志， 是判断非人哺乳动物卵母细胞功能正常与否的可靠指标。

非人哺乳动物卵母细胞膜电位研究可以追溯到1946年，海星等海生小动物卵细胞受精时膜上离子通道的变化。海星的无成熟卵电压依赖式电流分3个阶段：Ca²⁺内流，短暂的快K⁺电流和内向K⁺整流电流。在激素诱发成熟期间，电流逐渐发生变化：Ca²⁺内流增大，K⁺整流电流减小， 膜的传导性降低， 成熟期间Na⁺、K⁺转运造成膜去极化。早在1985 年和1994年Moreau和Dale就分别对非人哺乳动物卵母细胞的膜电位进行了研究。他们认为，非人哺乳动物卵母细胞成熟的标志之一就是膜电位变化。对于多数细胞来说，膜电位是稳定的直流电位，只要细胞维持正常的新陈代谢，该电位就稳定在某一相对稳定的水平。非人哺乳动物卵母细胞则不然，因为非人哺乳动物卵母细胞是高度特化的细胞，其主要功能是维持受精和胚胎发育，其内部的代谢活动自发变化而产生某种内源性刺激，膜电位也随之而自发变化。研究证明，所有动物的质膜上都有离子通道，在卵泡发育和受精过程中细胞膜逐渐去极化，是由于膜上离子通道的通透性发生了改变。取决于细胞内Ca²⁺的水平，细胞内Ca²⁺浓度升高引起细胞膜去极化，Ca²⁺是第二信使。

发明内容