[发明专利]先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用

说明书

本申请涉及生物技术领域，具体而言，涉及先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用。该构建方法包括：S1、以Lpin1基因为目的基因构建同源重组载体，针对Lpin1基因的第16和18外显子设计gRNA1和gRNA2，所述gRNA1和gRNA2分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；S2、体外转录合成所述gRNA1、gRNA2和Cas9 mRNA；S3、将所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和同源重组载体显微注射至健康的C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；S4、将所述F0代小鼠通过杂交和/或自交的方式获得Lpin1纯合突变的小鼠模型。本申请能够应用于肌无力相关预防、治疗或诊断手段及药物的研发，对相关药物及手段的筛选具有重要生理意义及特异性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用。

背景技术

肌无力是由肌肉、神经和代谢紊乱导致的神经肌肉类疾病(Goronzy JJ,WeyandCM.Immune aging and autoimmunity.Cell Mol Life Sci.2012；69:1615-23；LorenzoniPJ,Scola RH,Kay CS,Werneck LC.Congenital myasthenic syndrome:a briefreview.Pediatr Neurol.2012；46:141-48.)。肌营养不良、炎症性肌病、神经肌肉疾病、运动神经元疾病和重症肌无力是常见的遗传性肌无力(Hellmann MA,Mosberg-Galili R,Steiner I.Myasthenia gravis in the elderly.J Neurol Sci.2013；325:1-5；Al-Chalabi A,Visscher PM.Motor neuron disease:Common genetic variants and theheritability of ALS.Nat Rev Neurol.2014；10:549-50.)。肌无力疾病的致病机理及相关治疗手段一直是研究热点。

Lpin1(磷脂酸磷酸酶1,PAP1,EC 3.1.3.4)基因编码，是一个Mg2+依赖的磷脂酸磷酸酶(PAP1)(Harris TE,Huffman TA,Chi A,Shabanowitz J,Hunt DF,Kumar A,etal.Insulin controls subcellular localization and multisite phosphorylation ofthe phosphatidic acid phosphatase,Lpin 1.J Biol Chem.2007；282:277-86.)，在体内起到控制脂质合成和参与能量代谢的功能(Donkor J,Zhang P,Wong S,O'Loughlin L,Dewald J,Bernard P C,et al.Aconserved serine residue is required for thephosphatidate phosphatase activity but not the transcriptional coactivatorfunctions of Lpin-1 and Lpin-2.J Biol Chem.2009；284:29968-78.)。在细胞质中，Lpin1蛋白作为PAP1酶，将磷脂酸(PA)转化为二酰基甘油(DAG)，合成甘油三酯(TAG)和磷脂；在细胞核中，Lpin1与转录因子互作，发挥转录共激活因子的作用，调控下游基因表达(Péterfy M,Harris TE,Fujita N,Reue K.Insulin-stimulated interaction with 14-3-3promotes cytoplasmic localization of Lpin-1 in adipocytes.J Biol Chem.2010；285:3857-64.)。

人类常染色体隐性Lpin1基因突变已被确定为复发、早发横纹肌溶解症(MIM#268200)的主要致病基因，这种疾病的特征是骨骼肌受损导致细胞蛋白(包括肌酸激酶和肌红蛋白)排泄到循环系统。这些研究支持了Lpin1除了在脂质合成和能量代谢中的生化功能外，在周围神经和骨骼肌发育中的重要作用。