[发明专利]一种船舶压载水中活体病原菌的快速定量检测方法

权利要求书

1.一种船舶压载水中活体病原菌的快速检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)收集待检测压载水中的菌体

将待检测压载水经0.45μm无菌醋酸纤维膜滤膜过滤后，将收集的菌体滤膜添加到样本保存液中，涡旋振荡器振荡后作为待测样本；

2)检测病原菌

在装有待测样品、标准品和阴性对照的离心管中添加核酸提取液；然后分别将加入核酸提取液的待测样品、标准品和阴性对照放入60℃的水浴锅中水浴，室温放置冷却；然后将分别带有检测大肠杆菌和肠球菌探针的磁珠和扩增检测液加入到待测样品、标准品和阴性对照的离心管中；加入SAT酶，在42℃条件下反应；

检测所使用的引物和探针，其中包含有：

1)用于检测大肠杆菌的引物对和探针，其中：

上游引物：5'-CTTGCTTGTTGGGGTTGT-3'，

下游引物：5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCCTAGGTGTTGTCAGCAT-3'，

探针：5'-GCAGUGUUAGGCCUUUUAGUUCCCACUGC-3'；

2)用于检测肠球菌的引物对和探针，其中：

上游引物：5'-GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG-3'，

下游引物：5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGATGTAGTTCTGACCTTGC-3'，

探针：5'-GCCUCGGGACGAAAGUCUGACCGAGACGAGGC-3；

3)用于霍乱弧菌的引物对和探针，其中：

上游引物：5'-TCCCCTAAGCAATACTCTGA-3'；

下游引物：5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATCACCTCGTTTGGACGTTGGGCCAGCA-3'；

探针：5'-CGCAUAGUGAAGAGAUCAUUCGAGUGCG-3'；

3)结果判定

实时荧光恒温检测仪的定性分析是以靶标dt值来表征结果，其中靶标dt值≤35则检测结果为阳性；

靶标dt＞40，且内标dt≤40，则表明检测结果有效，样品中活体病原菌的检测结果为阴性或未检出。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标准品为标准菌株梯度溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的标准菌株梯度溶液，其中大肠杆菌为1×10²cfu/mL，1×10³cfu/mL，1×10⁴cfu/mL，1×10⁵cfu/mL，肠球菌为1×10cfu/mL，1×10²cfu/mL，1×10³cfu/mL，1×10⁴cfu/mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阴性对照为样本保存液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌标准曲线公式为y＝-4.1509x+13.098，R²＝0.9705；肠球菌标准曲线公式为y＝-3.5619x+11.086，R²＝0.963。