[发明专利]一种船舶压载水中活体病原菌的快速定量检测方法

说明书

本发明提供一种船舶压载水中活体病原菌的快速定量检测方法以及霍乱弧菌的快速定性方法，能够快速定量或定性检测船舶压载水中的活体大肠杆菌、肠道球菌和霍乱弧菌，从而弥补现有检测方法耗时的缺点。本发明能够在短时间内快速检测压载水中的活体病原菌，省去了传统人工培养法的繁琐的操作，节约了时间，能够快速给出定量或定性结果。

技术领域

本发明属于船舶压载水检测技术领域，具体涉及压载水公约D-2排放标准的一种船舶压载水中三类活体病原菌大肠杆菌、肠道球菌的快速定量检测方法以及有毒霍乱弧菌的快速定性方法。

背景技术

为防止有害外来生物的传播，国际海事组织(IMO)2004年制定了《国际船舶压载水及其沉积物控制与管理公约》，并于2017年9月8日正式实施。作为IMO常任理事国和全球最大的压载水输出输入国，2019年1月22日公约正式对我国生效。根据公约要求，各港口国需要根据D-2标准对船舶排放压载水中的活体病原菌进行定量或定性评价，其中要求大肠杆菌含量小于250cfu/100ml、肠道球菌含量小于100cfu/100ml，有毒霍乱弧菌含量小于1cuf/100ml，即100ml体系中不能检出。

然而公约并没有规定检测这些病原菌的标准方法，参考的是已有的国际标准，大肠杆菌检测参考ISO9308-3或ISO 9308-1，肠道球菌检测参考ISO 7899-1或ISO7899-2，有毒霍乱弧菌检测参考ISO/TS 21872-1/13。以上方法都是基于培养法，即对单位体积水样进行过滤后，将滤膜放置在相应的选择性培养基上培养计数，有毒霍乱弧菌定性检测除了培养外还通过PCR分子生物学方法进行分型判定，培养检测时间通常需要24～48小时。由于船舶靠岸后如不能尽快排放压载水，就会影响装卸货，靠港时间每增加一天将对船东造成几十万元的损失。

而已有的基于DNA芯片的快速检测方法并不能区分死活或活菌，因为环境中死亡的病原菌中也能提取到DNA，所以无法区分环境中病原菌的死活状态，无法满足压载水对活体病原菌评价的需求。由于细菌中的RNA在死亡后很快会被降解，且拷贝数是DNA的上千倍，所以本发明利用RNA的特性，采用RNA恒温扩增快速检测压载水中活体病原菌，该方法不仅灵敏度高，避免死菌带来的假阳性；相对于培养法，检测时间也从2～3天缩短到了4～5小时。这项技术的发明将填补压载水活体病原菌快速检测技术空白，不仅为履行压载水公约提供技术支撑，同时也具有巨大的市场开发价值。

发明内容

本发明提供一种船舶压载水中活体病原菌(大肠杆菌、肠道球菌)的快速定量检测方法以及霍乱弧菌的快速定性方法，能够快速定量或定性检测船舶压载水中的活体大肠杆菌、肠道球菌和霍乱弧菌，从而弥补现有检测方法耗时的缺点。

本发明所提供的一种船舶压载水中活体病原菌的快速检测方法，包括如下的步骤：

1)收集待检测压载水中的菌体

将待检测压载水经0.45μm无菌醋酸纤维膜滤膜过滤后，将收集的菌体滤膜添加到样本保存液中，涡旋振荡器振荡后作为待测样本；

2)检测病原菌

在装有待测样品、标准品和阴性对照的离心管中添加核酸提取液；然后分别将加入核酸提取液的待测样品、标准品和阴性对照放入60℃的水浴锅中水浴，室温放置冷却；然后将分别带有检测大肠杆菌和肠球菌探针的磁珠和扩增检测液加入到待测样品、标准品和阴性对照的离心管中；加入SAT酶，在42℃条件下反应。

所述的标准品和阴性对照分别为；标准品为标准菌株梯度溶液，大肠杆菌为1×10²cfu/mL，1×10³cfu/mL，1×10⁴cfu/mL，1×10⁵cfu/mL，肠球菌为1×10cfu/mL，1×10²cfu/mL，1×10³cfu/mL，1×10⁴cfu/mL。阴性对照可使用样本保存液。