[发明专利]冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用

说明书

本发明公开了一种冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用，本发明冻存液包括以下质量百分含量的组份：海藻酸钠0.25％～1％、十二烷基硫酸钠0.05％～0.2％、甲基纤维素0.01％～0.02％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液2％～5％，余量为注射用水。本发明冻存液对多种免疫细胞进行验证表明，经过本发明冻存液冷冻保存的免疫细胞仍能满足临床应用所要求的高活率和高效杀伤肿瘤细胞能力，且本发明冻存液成分安全无毒，生产成本低，冻存方法简便，使得在临床应用中更加安全可靠，具有广泛的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及低温冻存技术领域，特别涉及一种冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用。

背景技术

免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。有杀伤肿瘤细胞作用的T细胞经激活后在体内大多数变为记忆细胞储存在淋巴组织内，为彻底清除肿瘤细胞和防治转移复发提供了长期保护。此方法适用于各种不同病理阶段肿瘤疾病的治疗，如呼吸系统的肺癌等、泌尿系统的肾癌等、肾上腺癌及其转移癌等、血液系统的急慢性白血病、还有肝癌、胃癌和肠癌等。免疫疗法的发展非常迅速，因此，成功有效的保存免疫细胞在基础临床和临床应用研究上具有重要意义。

近年来，细胞、组织和器官的冷冻保存备受关注，冷冻保存技术的突破将为再生医学的发展提供强有力的理论和实验支撑。人工开发出来适用于实验的冷冻细胞的方法具有诸多优点，例如减少基因漂移、减缓细胞衰老、稳定表型和减少微生物污染及交叉污染机会等。其中，细胞冻存是将细胞放在低温环境中，使细胞暂时脱离生长状态，进而减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其中，细胞冻存时向细胞悬液中加入冷冻保护剂，可使溶液冰点下降，减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞在冷冻过程中的损伤，因此，选择适当的冷冻保护剂才能最大限度的保存细胞。

目前较多的免疫细胞冻存液主要组分是细胞基础培养基、胎牛血清和DMSO等，此外还有采用替代DMSO的冻存液，尽管成本低效果好，但它能与蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，对细胞具有一定的毒副作用，不能用于治疗用细胞的冻存。还有用替代胎牛血清的冻存液，虽然不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，但该冷冻液的免疫细胞存活率低，因此不能直接用于临床回输。

如公开号“CN202110997925.8”，名称为“一种免疫细胞的冻存液及冻存方法”的发明申请公开了一种免疫细胞的冻存液，所述冻存液中包括冻存液和冷冻保护剂，所述冻存液中包括胎牛血清、1640培养液、低分子肝素钙和抗氧化剂，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜(DMSO)。其虽然能够提高免疫细胞冻存效果且保证复苏后细胞活性和细胞增殖能力不受影响，但是由于采用含有带有毒性的DMSO和比较昂贵的胎牛血清成份，不利于复苏后免疫细胞在临床和临床应用研究。为此，寻找到一种新型的冷冻保存剂，在成分简单，不添加DMSO和外源蛋白的前提下，通过控制冷冻保存过程中的结冰、抑制冰晶重结晶、调控冰晶形貌和生长速率，实现免疫细胞的长期及大量保存。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于，提供一种冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用。所述冻存液的配方合理，成分安全，稳定性好，可有效解决现有技术中免疫细胞冻存液具有一定毒性以及容易引起免疫排斥反应的问题。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：

一种冻存液的制备方法，其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：海藻酸钠0.25％～1％、十二烷基硫酸钠0.05％～0.2％、甲基纤维素0.01％～0.02％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、PBS缓冲液2％～5％，余量为水，优选为注射用水；

(2)往所述水中加入海藻酸钠，搅拌溶解，获得海藻酸钠溶液；