[发明专利]病毒检测

说明书

本发明涉及用于在样品中检测和区分靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法、以及包含所述试剂盒和用于所述方法的装置。本发明使用限制酶、聚合酶和寡核苷酸引物，在靶病原体存在时产生扩增产物，所述扩增产物与寡核苷酸探针接触以产生检测物分子。

技术领域

本发明涉及用于检测和区分样品中的甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法，以及含有所述试剂盒和用于所述方法的装置。

背景技术

流感是呼吸道的传染性病毒感染。甲型流感是人类最常见的流感病毒类型，主要导致季节性流感流行，偶尔也会导致大流行。乙型流感病毒是不太常见的流行病原因。呼吸道合胞病毒(RSV)由两种毒株(A亚组和B亚组)组成，也是主要影响婴儿和老年人的传染病的原因。RSV的主要季节与流感季节重叠。使用分子诊断方法来识别感染流感和RSV的患者，有利于流行病和大流行病的有效控制、适当治疗选择和预防。

基于聚合酶的核酸序列扩增方法广泛用于分子诊断领域。最成熟的方法，聚合酶链反应(PCR)，通常涉及每个靶序列使用两个引物，在循环指数扩增过程中通过温度循环实现引物退火、DNA聚合酶延伸和新合成的DNA的变性。温度循环需要复杂设备进行，这限制了基于PCR的方法在某些应用中的使用。

链置换扩增(SDA)(EP0497272；US5455166；US5712124)被开发出来，作为替代PCR的一种等温方法，该方法无需温度循环在聚合酶扩增过程中实现双链DNA的退火和变性，而是用限制酶与链置换聚合酶的组合来分开两条DNA链。

在SDA中，在存在一种或多种α-巯基核苷酸的情况下，位于每个引物5'端的限制酶位点被引入扩增产物中，并且凭借限制酶仅切割其识别位点的半硫代磷酸酯形式的未修饰链的能力，用限制酶在限制位点产生切口。链置换聚合酶延伸每个切口的3'端并置换下游DNA链。通过有义反应和反义反应的偶联，产生指数扩增，其中从有义反应中置换出的链作为反义反应的靶，且反之亦然。SDA通常需要进行1个多小时，这大大限制了其在临床诊断领域的应用潜力。此外，扩增后产物的特异性检测和反应的起始都需要分开的程序来进行，这也增加了该方法的显著复杂性。

Maples等人(WO2009/012246)随后使用切口酶(nicking enzyme)进行SDA，切口酶是限制酶的一个子类，该酶在与其特异性双链识别序列结合后，仅能切割DNA的两条链中的一条。他们将这种方法称为切口和延伸扩增反应(NEAR)。利用切口酶而不是限制酶的NEAR随后也被其他人所利用，他们尝试了使用软件优化的引物(WO2014/164479)、通过温启动或有控制的降温(WO2018/002649)来改进方法。然而，只有极少数的切口酶可得，因此寻找一种对特定应用具有所需性质的酶更具挑战性。

使用限制酶或切口酶(NEAR)的SDA的一个关键缺点是它产生双链核酸产物，因此并不提供可用于有效检测扩增信号的内在过程。这大大限制了它在例如低成本诊断装置中的应用。所产生的扩增产物的双链性质，对于将扩增方法与信号检测偶联，提出了挑战，这是因为在不首先分离两条链的情况下将不可能进行基于杂交的检测。因此，需要更复杂的检测方法，如分子信标和荧光团/淬灭剂探针，这会因要求单独的过程步骤而使测定方案复杂化，并显著降低开发多重测定(multiplex assay)的潜力。

为克服SDA的局限性和允许有效地检测流感和RSV，因此十分需要可以应用增强型扩增方法以快速、灵敏和特异地进行核酸序列检测的分子诊断试验。本发明涉及在样品中检测和区分甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法，所述的试剂盒和方法并入了核酸扩增，并且通过组合使用具有5'限制性位点的引物对和寡核苷酸探针对，产生了能够允许有效信号检测的检测物分子(detector species)。

发明概述

本发明提供用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其中，分别针对每种病原体，所述试剂盒包含以下组分(a)、(b)和(c)：