[发明专利]具有最小折射表面的多浸没式显微镜物镜

说明书

本发明涉及一种用于检查在浸渍介质(M)中的样品(S)的浸没式显微镜物镜(10)，包括：至少一个凹面镜(3)，至少一个光学元件(1)，其包括面向至少一个凹面镜(3)的非球面表面(2)，以及布置在至少一个凹面镜(3)和所述非球面表面(2)之间的内部空间(4)，所述内部空间(4)被配置为填充有浸没介质(M)，使得浸没介质(M)接触述至少一个凹面镜(3)和非球面表面(2)。根据本发明，非球面界面(2)被成形为使得当所述浸没介质(M)的折射率n增加或减小至少0.025时，浸没式显微镜物镜(10)的工作距离(7)变化小于1％。

技术领域

本发明涉及一种用于检查浸没介质中的样品的浸没式显微镜物镜以及包括这种物镜的显微镜。

背景技术

在诸如激光扫描显微镜的显微镜中，用光束检查样品，该光束被连续地引导到样品的各个部分，同时用光检测器和数据采集系统[1]采集样品响应的光学信号。由样品产生的信号可以是由于反射、散射、极化、单光子或多光子激发的荧光、以及诸如谐波产生和拉曼散射的其他物理过程。为了产生整个样品的图像，通过平移样品(载物台扫描)或由光学扫描系统平移光束，使光束或样品在整个感兴趣区域上进行光栅扫描。这种扫描系统可以利用振镜式扫描镜、声光偏向器、多边形扫描仪和其它光学元件。由扫描系统引入的光束偏转由链接到数据采集系统的控制系统操纵。通常，利用中间光学系统(例如，扫描透镜和镜筒透镜)将扫描光束传递到显微镜物镜，显微镜物镜将光束聚焦到样品上(参见图1)。

除了光栅扫描之外，可以采用其他扫描模式来检查样品(例如线扫描、螺旋扫描和随机扫描)，这允许在扫描周期期间的目标点的数目减少时更快地获取样品内的生物、化学或物理事件，这进而允许扫描模式的更高重复频率。许多激光扫描显微镜还提供了利用光束来光学刺激或改性样品或其子区域的可能性，例如通过激光显微外科、光捕获、光遗传学技术、去掩蔽、光漂白或荧光漂白恢复(FRAP)[1]。许多激光扫描显微镜利用技术来生成光学切片图像，即，能够产生看起来与利用相同模态成像的机械切片样品等效的数据集。通过减少来自远离显微镜物镜的聚焦区的样品部分的背景信号来实现光学切片。这种减少可以使用光学装置来实现，例如通过使用共焦显微镜[1]中的共焦针孔从焦点外的区域中排除光，或者通过照射样品使得显微镜物镜的聚焦区之外的很少或没有信号产生，例如使用光片显微镜中的侧照射。光学切片还可以通过使用诸如去卷积的方法对所获取的数据进行计算处理来实现。此外，光学切片图像可以通过利用非线性光-物质相互作用产生，例如多光子显微方法，例如双光子、三光子、四光子显微方法，二次和三次谐波产生，相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)。在这些方法中，多个光子需要与样品内的分子相互作用，因此所产生的信号非线性地取决于照明强度，具有比单位功率高的功率。例如，双光子信号取决于照明强度的平方。当照明强度在照明光束的聚焦区之外急剧下降时，多光子过程中的有效激发体积在空间上被限制在围绕该焦点区域的三维空间中，这产生光学切片效应。通过使用在近红外区光谱(700-2500nm)中操作的脉冲皮秒或飞秒激光，非线性激发过程可以用于产生荧光，该荧光可以用在可见区中操作的光检测器(例如照相机、光电倍增管或光电二极管)检测。在许多多光子显微方法(例如双光子和三光子显微)中，通过从样品收集尽可能多的光的光电探测器，使用非线性过程检测样品内部产生的光就足够了(非去扫描检测)。

现代激光扫描显微镜的设计中的关键挑战在于存在显微镜光学器件需要对其校正的各种浸没介质。当对用组织清除技术[2]处理的样品成像时，这是特别重要的，所述组织清除技术在化学上使生物组织透明并因此可被可见光穿透。通过去除诸如作为散射体的脂质的组织成分，清除技术减少散射并使整个样品的折射率均匀化。目前，存在多种这样的清除技术，例如Scale[3]、3DISCO[4]、iDISCO[5]、vDISCO[6]、uDISCO[6]、CLARITY[7]，[8]和CUBIC[9](也参见图2)。作为每个清除方案中的最后步骤，将样品置于通过扩散平衡折射率的液体介质中。