[发明专利]一种从蚕蜕或蛹蜕样品中快速提取基因组DNA的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种从蚕蜕或蛹蜕样品中快速提取基因组DNA的试剂盒，其特征在于，主要由下述3种缓冲液组成：

1)BufferA，组分为：100mmol/L Tris-HCL，pH 7.5；100mmol/L EDTA；100mmol/L NaCl；0.5％SDS；所述BufferA的pH值为7.5，溶剂为蒸馏水；

2)BufferB，5mol/L KAC与6mol/L LiCl进行1:2.5的体积比进行配置而成；

3)BufferC，为无水乙醇，使用前加入25ml ddH₂O混匀，预冷使用。

2.采用如权利要求1所述的试剂盒从蚕蜕或蛹蜕中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取蚕蜕或蛹蜕放于研钵中，液氮充分研磨，然后加入BufferA研磨至细粉末状；

2)将粉末小心转移至离心管中，65℃水浴2小时，期间取出上下混匀2次；

3)加BufferB上下轻轻混匀，置冰上10min；

4)4℃12000rpm离心15min；

5)小心吸取上清液于新的离心管中，操作过程中避免吸取底部沉淀；

6)加入预冷异丙醇，轻轻混匀，放置15min，可见白色絮状沉淀产生；

7)弃上清，加入BufferC清洗2次，自然干燥；

8)加入TE buffer或ddH2O，充分溶解DNA，-20℃保存备用。

3.使用SSR标记技术对如权利要求2所述方法抽提得到的基因组DNA进行扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)SSR引物选择：选取SSR引物S1215

Forward-GCACTTTATCTCCTCAGCTACCG

Reverse-TTGGAATAGAGTGGCACGGTTT

(2)PCR扩增

所用PCR仪为Flexigene,Techne

当PCR反应体系为20μl，所用PCR反应试剂及用量分别如下：

为了增加PCR的特异性，实验采用Touch Down PCR(TD-PCR)程序：

94℃变性：5min

第1个循环：94℃30sec，63℃1min，72℃1min；

第2个循环：94℃30sec，62.5℃1min，72℃1min；

第3个循环：94℃30sec，62℃1min，72℃1min；

……

第15个循环：94℃30sec，56℃1min，72℃1min；

前15个循环退火温度每次降低0.5℃，由63℃降至56℃；后25个循环退火温度采用56℃，即

第16-25个循环：94℃30sec，56℃1min，72℃1min；

72℃延伸：5min；

4℃保温；

PCR反应结束后，取3μl产物在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳分离，并以标准浓度的DL2000DNA作为标准，检测PCR产物的扩增效果及浓度。