[发明专利]热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体及其应用

说明书

热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体及其应用，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的葡聚糖酶BisGlu16B_∆C分别进行T40K、Q53L和S311Y突变，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，获得所述热稳定性改良的葡聚糖酶突变体T40K、Q53L和S311Y。经过改造优化，获得的突变体在60℃下的热稳定性得到了明显提升，进一步满足了饲料用酶的要求，因此，本发明中热稳定性提升的葡聚糖酶突变体T40K、Q53L和S311Y在饲料工业中展现出巨大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，涉及一种热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

β-葡聚糖是植物细胞壁的重要多糖组分，由β-D-葡萄糖残基通过1,3-β-糖苷键和1,4-β-糖苷键连接而成。实现生物质多糖快速降解主要包括两种因素，一是加速纤维素和半纤维素大分子的彼此分离和释放，二是酶将多糖水解为寡糖。β-葡聚糖酶是降解β-葡聚糖的主要酶类，其在工业生产中具有重要应用价值，如在啤酒酿造中添加β-葡聚糖酶可增加啤酒澄清度从而改善啤酒口感，在饲料中添加β-葡聚糖酶可有效降低单胃动物肠道食糜黏度，消除葡聚糖的抗营养作用，提高饲料利用率。

根据切割糖苷键的类型可将β-葡聚糖酶分为以下4种类型：β-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)和β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)。其中β-1,3-1,4-葡聚糖酶(下称β-葡聚糖酶)的催化活性最高，可通过特异性切割1,3-键相邻的β-1,4-糖苷键将葡聚糖或地衣多糖降解为以纤维三糖和纤维四糖为主的低聚寡糖，因此具有最广泛的应用价值，然而目前报道的大部分β-葡聚糖酶的热稳定性依旧不能满足工业应用的要求。

提高酶的热稳定性可以有效拓宽酶在工业中的应用范围，同时有助于研究者了解酶结构与稳定性之间内在联系。在实际生产中，谷物内源性β-葡聚糖酶在制麦过程和麦汁糖化过程中会丧失大部分酶活。在饲料制粒过程中β-葡聚糖酶会快速丧失活性。为了满足工业生产的需求，需要通过新酶筛选和蛋白质工程手段对β-葡聚糖酶的稳定性进行改造研究。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是采用理性设计方法通过对来源于丝状真菌Bispora sp.MEY-1的葡聚糖酶BisGlu16B_ΔC(WT)进行改造，获得耐高温的突变体，以更适应饲料添加，确保酶在饲料高温制粒过程中不会失活从而有效消除抗营养因子的负面作用。

技术方案：一种热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体，对氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的葡聚糖酶BisGlu16B_ΔC分别进行T40K、Q53L和S311Y突变，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，获得所述热稳定性改良的葡聚糖酶突变体T40K、Q53L和S311Y。

编码上述3个热稳定性改良的葡聚糖酶突变体的氨基酸序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

包含任一上述热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体基因的重组表达载体。

包含任一上述热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体基因的重组载体pPIC9-T40K、pPIC9-Q53L和pPIC9-S311Y。

包含上述重组载体的重组菌株。

上述重组菌株为重组毕赤酵母菌GS115/T40K、GS115/Q53L和GS115/S311Y。

上述热稳定性提升的酸性葡聚糖酶突变体在饲料生产中的应用。